Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои натиҷаҳои беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки версияи навтари браузери худро истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услуб ё JavaScript нишон медиҳем.
Кашф ва истифодаи судманди маҳсулоти табиӣ метавонад ба беҳтар шудани зиндагии инсон мусоидат кунад.Моддаҳои кимиёвии монеъкунандаи афзоиши растанӣ ҳамчун гербисидҳо барои мубориза бо алафҳои бегона васеъ истифода мешаванд.Аз сабаби зарурати истифода бурдани навъҳои гуногуни гербицидҳо зарурати муайян кардани пайвастагиҳои дорои механизмҳои нави таъсир ба миён меояд.Дар ин таҳқиқот, мо як пайвастагии нави N-алкоксипиррол, кумамонамидро аз Streptomyces werraensis MK493-CF1 кашф кардем ва раванди пурраи синтезро муқаррар кардем.Тавассути санҷишҳои фаъолияти биологӣ, мо фаҳмидем, ки кислотаи урс-моноамикӣ мобайнии синтетикии урс-моноамид ва потенсиали он аст.ингибитори афзоиши растанӣ.Илова бар ин, мо ҳосилаҳои гуногуни кислотаи урбенониро таҳия кардем, аз ҷумла ҳосилаи урбенилокси (UDA), ки дорои фаъолияти баланди гербицидӣ бидуни таъсири манфӣ ба афзоиши ҳуҷайраҳои HeLa мебошад.Мо инчунин дарёфтем, ки ҳосилаҳои кислотаи урмотоникӣ микротубулҳои растанӣ вайрон мекунанд;гайр аз ин, КАНД ба филаментхои актин таъсир мерасонад ва боиси марги хучайра мегардад;Ин таъсироти гуногунҷанба аз таъсири ингибиторҳои маълуми микротубулҳо фарқ мекунанд ва механизми нави амали кислотаи урсониро пешниҳод мекунанд, ки бартарии муҳимро дар таҳияи гербисидҳои нав нишон медиҳад.
Кашф кардан ва дар амал татбик намудани махсулоти фоиданоки табий ва хосил-хои онхо воситаи бехтар намудани сифати хаёти инсон мебошад.Метаболитҳои дуюмдараҷае, ки аз ҷониби микроорганизмҳо, растанӣ ва ҳашарот истеҳсол карда мешаванд, дар соҳаи тиб ва кишоварзӣ ба пешравиҳои калон оварда расониданд.Аз маҳсулоти табиӣ бисёр антибиотикҳо ва доруҳои зидди лейкоз таҳия карда шудаанд.Илова бар ин, намудҳои гуногунипестицидхо, аз ин махсулоти табий барои истифода дар хочагии кишлок фунгицидхо ва гербицидхо хосил карда мешаванд.Аз ҷумла, гербисидҳои зидди алафҳои бегона воситаи муҳими баланд бардоштани ҳосили зироат дар кишоварзии муосир мебошанд ва намудҳои гуногуни пайвастагиҳо аллакай дар тиҷорат истифода мешаванд.Якчанд равандҳои ҳуҷайравӣ дар растаниҳо, аз қабили фотосинтез, мубодилаи аминокислотаҳо, синтези девори ҳуҷайра, танзими митоз, сигнализатсияи фитогормонҳо ё синтези сафедаҳо, ҳадафҳои маъмулии гербисидҳо ҳисобида мешаванд.Пайвастҳое, ки фаъолияти микротубулҳоро бозмедоранд, як синфи маъмули гербисидҳо мебошанд, ки ба афзоиши растанӣ тавассути таъсир ба танзими митоз таъсир мерасонанд2.
Микротубулҳо ҷузъҳои ситоскелет мебошанд ва дар ҳуҷайраҳои эукариотӣ ба таври васеъ нигоҳ дошта мешаванд.Гетеродимери тубулин аз α-тубулин ва β-тубулин иборат аст, ки протофиламентҳои хаттии микротубулинро ташкил медиҳанд ва 13 протофиламент сохтори силиндрӣ ташкил медиҳанд.Микротубулҳо дар ҳуҷайраҳои растанӣ нақшҳои гуногун доранд, аз ҷумла муайян кардани шакли ҳуҷайра, тақсимоти ҳуҷайраҳо ва интиқоли дохили ҳуҷайраҳо3,4.Ҳуҷайраҳои растанӣ дар зери мембранаи плазмаи байнифазавӣ микротубулҳо доранд ва чунин мешуморанд, ки ин микротубулҳои ба ном кортикалӣ ташкили микрофибрилҳои селлюлозаро тавассути танзими комплексҳои синтазаи селлюлоза назорат мекунанд4,5.Микронайчахои кортикалии хучайрахои эпидермалии реша, ки дар минтакаи дарозшавии босуръати нўги реша чойгиранд, дар паҳлуӣ ҷойгир шудаанд ва микронахҳои селлюлоза аз паи ин микронайчаҳо буда, самти васеъшавии ҳуҷайраҳоро маҳдуд мекунанд ва бо ҳамин ба дарозшавии ҳуҷайраҳои анизотропӣ мусоидат мекунанд.Аз ин рӯ, функсияи микротубула бо морфологияи растанӣ зич алоқаманд аст.Ҷойивазкунии кислотаи аминокислотаҳо дар генҳое, ки тубулинро рамзгузорӣ мекунанд, боиси каҷшавии массивҳои микротубулҳои кортикалӣ ва афзоиши чап ё рост дар Arabidopsis 6,7 мегардад.Ба ҳамин монанд, мутатсияҳо дар сафедаҳои бо микротубула алоқаманд, ки динамикаи микротубуларо танзим мекунанд, инчунин метавонанд ба афзоиши решаҳои таҳрифшуда оварда расонанд8,9,10,11,12,13.Илова бар ин, табобат бо гербисидҳои вайронкунандаи микротубулҳо, аз қабили дизопирамид, ки бо номи претилахлор низ маълум аст, боиси афзоиши решаи чапи чапи чап мегардад14.Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки танзими дақиқи функсияи микротубулҳо барои муайян кардани самти нашъунамои растанӣ муҳим аст.
Намудҳои гуногуни ингибиторҳои микротюбула кашф карда шудаанд ва ин доруҳо ба тадқиқоти ситоскелетӣ, инчунин дар соҳаи кишоварзӣ ва тиб саҳми калон гузоштанд2.Аз ҷумла, пайвастагиҳои оризалин, динитроанилин, дизопирамид, пайвастагиҳои ба бензамид алоқаманд ва аналогҳои онҳо метавонанд фаъолияти микронайчаҳоро боздоранд ва ба ин васила нашъунамои растаниҳоро боздоранд.Аз ин рӯ, онҳо ҳамчун гербицид васеъ истифода мешаванд.Аммо, азбаски микротубулҳо ҷузъи муҳими ҳуҷайраҳои растанӣ ва ҳайвонот мебошанд, аксари ингибиторҳои микротубулҳо барои ҳарду намуди ҳуҷайра ситотоксикӣ мебошанд.Аз ин рӯ, сарфи назар аз фоиданокии онҳо ҳамчун гербисидҳо, шумораи маҳдуди агентҳои зиддимикротубулӣ барои мақсадҳои амалӣ истифода мешаванд.
Streptomyces як ҷинси оилаи Streptomyces мебошад, ки бактерияҳои аэробӣ, грамм-мусбат ва филаментдорро дар бар мегирад ва бо қобилияти худ барои тавлиди доираи васеи метаболитҳои дуюмдараҷа маълум аст.Аз ин рӯ, он яке аз муҳимтарин манбаъҳои маҳсулоти нави табиии аз ҷиҳати биологӣ фаъол ҳисобида мешавад.Дар тадқиқоти ҷорӣ мо як пайвастагии нав бо номи кумамонамидро кашф кардем, ки аз Streptomyces werraensis MK493-CF1 ва S. werraensis ISP 5486 ҷудо карда шудааст. Бо истифода аз таҳлили спектралӣ ва таҳлили пурраи спектралӣ сохтори кумамонамид ва скелети беназири N-алкоксипирроли он тавсиф карда шуд. муайян карда шуд.синтез.Кислотаи Урсмоник, як мобайнии синтетикии урсмоноамид ва ҳосилаҳои он, муайян карда шуд, ки нашъунамо ва нашъунамои растании машҳури арабидопсис thalianaро бозмедорад.Дар омӯзиши робитаи сохтор ва фаъолият, мо дарёфтем, ки пайвастагие бо C9 ба кислотаи урсоникӣ, ки ҳосилаи nonyloxy кислотаи урсоникӣ (KAND) номида мешавад, таъсири ингибиторро ба афзоиш ва сабзиш ба таври назаррас афзоиш медиҳад.Қобили зикр аст, ки ингибитори афзоиши растаниҳои нав кашфшуда ба афзоиши тамоку ва ҷигар таъсир расонд ва барои бактерияҳо ё ҳуҷайраҳои HeLa ситотоксикӣ набуд.Ғайр аз он, баъзе ҳосилаҳои кислотаи урмотоникӣ фенотипи решаи вайроншударо ба вуҷуд меоранд, ки ин ҳосилаҳои мустақим ё бавосита ба микротубулҳо таъсир мерасонанд.Мутобиқи ин ақида, мушоҳидаҳои мо дар бораи микротубулҳо, ки ба таври иммуногистохимикӣ ё сафедаҳои флуоресцентӣ нишон дода шудаанд, нишон медиҳанд, ки табобати КАНД микротубулҳоро деполимеризатсия мекунад.Илова бар ин, табобат бо ҳосилаҳои кислотаи кумамотонӣ микрофиламентҳои актинро вайрон кард.Ҳамин тариқ, мо як ингибитори нави афзоиши растаниҳоро кашф кардем, ки механизми беназири амали он нобудшавии ситоскелетро дар бар мегирад.
Штамми MK493-CF1 аз хок дар Шинагава-ку, Токио ҷудо карда шуд.Штамми MK493-CF1 мицелий стромалии хуб шохадорро ташкил дод.Пайдарпайии қисман гени РНК-и рибосомаии 16S (1422 bp) муайян карда шуд.Ин штамм ба S. werraensis хеле монанд аст (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: штамми маъмулӣ, 99,93%).Дар асоси ин натиҷа муайян карда шуд, ки ин штамм бо штамми навъи S. werraensis зич алоқаманд аст.Аз ин рӯ, мо муваққатан ин штаммро S. werraensis MK493-CF1 номидем.S. werraensis ISP 5486T низ ҳамин пайвастагиҳои биоактивиро тавлид мекунад.Азбаски дар бобати ба даст овардани махсулоти табий аз ин микроорганизм тадкикоти пештара кам буд, тадкикоти минбаъдаи химиявй гузаронда шуд.Пас аз парвариши S. werraensis MK493-CF1 дар муҳити ҷав тавассути ферментатсияи ҳолати сахт дар 30°С дар тӯли 14 рӯз, миёна бо 50% EtOH истихроҷ карда шуд.60 мл намуна барои ба даст овардани 59,5 мг экстракт хом хушк карда шуд.Иқтибоси хом ба марҳилаи баръакси HPLC гузаронида шуд, то N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид (1, бо номи кумамонамид, 36,0 мг) дод.Маблағи умумии 1 тақрибан 60% истихроҷи хомро ташкил медиҳад.Бинобар ин, мо тасмим гирифтем, ки хосиятҳои кумамотоамид 1-ро муфассал омӯзем.
Coumamonamide 1 як хокаи аморфии сафед аст ва масс-спектрометрияи баландсифат (HRESIMS) C6H8N2O2-ро тасдиқ мекунад (расми 1).Порчаи пирроли C2 ивазшудаи ин пайвастагӣ бо δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH дар спектри 1H NMR: 4.5 Гц тавсиф карда мешавад. , H-5) ва δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6) ва спектри 13C NMR мавҷудияти чор атоми карбон sp2-ро нишон медиҳад.Мавҷудияти як гурӯҳи амидӣ дар мавқеи C2 бо таносуби HMBC аз протони C-3 то карбони амидии карбонил дар δC 161.1 арзёбӣ карда шуд.Илова бар ин, қуллаҳои 1 H ва 13 C NMR дар δH 4.10 (3H, S) ва δC 68.3 мавҷудияти гурӯҳҳои N-метокси дар молекуларо нишон медиҳанд.Гарчанде ки мавқеи дурусти гурӯҳи метокси ҳанӯз бо истифода аз таҳлили спектроскопӣ, ба монанди спектроскопияи мукаммали фарқият ва ихтисораи ядроии Overhauser (NOEDF) муайян карда нашудааст, N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид аввалин пайвастагии номзад шуд.
Барои муайян кардани сохтори дурусти 1 синтези умуми гузаронида шуд (расми 2а).Муолиҷаи 2-аминопиридин 2 бо m-CPBA, ки дар тиҷорат дастрас аст, боиси ҳосили миқдории мувофиқи N-оксиди 3 гардид.Пас аз 2-аминоазидизатсияи 2, реаксияи циклоконденсатсия, ки Абрамович тавсиф кардааст, дар бензол дар ҳарорати 90 ° C гузаронида шуд, то 1-гидрокси-1Н-пиррол-2-карбонитрил 5-ро дар грамм ба даст овард.Суръат 60% (ду марҳила).15,16.Метилизатсия ва гидролизи 4 пас аз он кислотаи 1-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксил (кислотаи кумотоникӣ номида мешавад) ҳосили хуб дод (70%, ду марҳила).Ниҳоят, амидизатсия тавассути миёнаравии кислотаи хлориди 6 бо истифода аз аммиаки обӣ ба Кумамото амид 1 дар 98% ҳосил дод.Ҳама маълумоти спектралии синтезшудаи 1 ба ҷудошудаи 1 монанд буданд, бинобар ин сохтори 1 муайян карда шуд;
Синтези умумӣ ва таҳлили фаъолияти биологии урбенамид ва кислотаи урбеникӣ.(а) Синтези умумии амид Кумамото.(б) Ниҳолҳои ҳафтрӯзаи навъи ваҳшии Арабидопси Колумбия (Кол) дар плитаҳои Мурашиге ва Скуг (MS), ки дорои кумамонамид 6 ё кумамонамид 1 мебошанд, дар консентратсияи нишондодашуда парвариш карда шуданд.Сатри миқёс = 1 см.
Аввалан, мо фаъолияти биологии урбенамид ва мобайнии онро барои қобилияти онҳо дар танзими афзоиши растанӣ арзёбӣ кардем.Мо консентратсияи гуногуни урсмонамиди 1 ё кислотаи урсмони 6-ро ба муҳити MS агар ва ниҳолҳои парваришшудаи Arabidopsis thaliana дар ин муҳити атроф илова кардем.Ин таҳлилҳо нишон доданд, ки консентратсияи баланд (500 мкм) 6 афзоиши решаро бозмедорад (расми 2б).Баъдан, мо бо иваз кардани мавқеи N1 6 ҳосилаҳои гуногун тавлид кардем ва дар онҳо таҳқиқоти робитаи сохтор ва фаъолият анҷом додем (раванди синтези аналогӣ дар Маълумоти дастгирӣ (СИ) тавсиф шудааст).Ниҳолҳои арабидопсис дар муҳити дорои ҳосилаҳои кислотаи урсоникӣ 50 мкм парвариш карда шуданд ва дарозии реша чен карда шуд.чунон ки дар расм нишон дода шудааст.Тавре ки дар расмҳои 3a, b ва S1 нишон дода шудааст, кислотаҳои кумамо дарозии гуногуни занҷирҳои алкоксии хатӣ (9, 10, 11, 12 ва 13) ё занҷирҳои калони алкоксиӣ (15, 16 ва 17) дар мавқеи N1 доранд.Ҳосилаҳо монеъшавии назарраси афзоиши решаро нишон доданд.Илова бар ин, мо дарёфтем, ки истифодаи 200 мкМ 10, 11 ё 17 нашъро бозмедорад (расмҳои 3c ва S2).
Омӯзиши робитаи сохтор ва фаъолияти амидҳои Кумамото ва пайвастагиҳои алоқаманд.$A) Сохтор ва схемаи синтези аналогхо.(б) Миқдори дарозии решаи ниҳолҳои 7-рӯза дар муҳити MS бо ҳосилаҳои 50 мкм кумамонамид ё бидуни он.Ситорачаҳо фарқияти назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (ttest, саҳ<0,05).н>18. Маълумот ҳамчун миёна ± SD нишон дода шудааст.nt маънои «санҷида нашудааст» -ро дорад, зеро зиёда аз 50% тухмиҳо неш задаанд.(в) Миқдори нашъунамои тухмиҳои коркардшуда дар тӯли 7 рӯз дар муҳити MS бо ё бе 200 мкм кумамонамид ва пайвастагиҳои алоқаманд.Ситорачаҳо фарқияти назаррасро бо табобати қалбакӣ (санҷиши хи-мураббаъ) нишон медиҳанд.n=96.
Ҷолиб он аст, ки илова кардани занҷирҳои паҳлӯи алкилӣ аз C9 дарозтар фаъолияти ингибиториро коҳиш дод ва аз он шаҳодат медиҳад, ки пайвастагиҳои марбут ба кислотаи кумамотӣ барои нишон додани фаъолияти биологии худ занҷирҳои паҳлӯии андозаи муайянро талаб мекунанд.
Азбаски таҳлили равобити сохтор ва фаъолият нишон дод, ки C9 ба кислотаи урсоникӣ тағир ёфтааст ва ҳосилаи нонилокси кислотаи урсоникӣ (минбаъд KAND 11 номида мешавад) муассиртарин ингибитори афзоиши растанӣ буд, мо тавсифи муфассали KAND 11-ро анҷом додем. Табобати арабидопсис бо 50 мкМ КАНД 11 сабзиши нашъро қариб пурра пешгирӣ кард, дар ҳоле ки консентратсияи пасти (40, 30, 20 ё 10 мкм) КАНД 11 афзоиши решаро ба воя вобаста ба воя бозмедорад (расми 4а, б).Барои санҷидани он, ки оё KAND 11 ба мавҷудияти меристемаи реша таъсир мерасонад, мо меристемаҳои решаи бо йодиди пропидиум (PI) рангшударо тафтиш кардем ва андозаи майдони меристемаро чен кардем.Андозаи меристемаи ниҳолҳои дар муҳити дорои 25 мкм КАНД-11 парваришшуда 151,1 ± 32,5 мкм буд, дар ҳоле ки андозаи меристемаи ниҳолҳои дар муҳити контроли дорои DMSO парваришшуда 264,7 ± 30,8 мкм буд (расми 4c, d) , ки ин нишон медиҳад, ки KAND-11 фаъолияти ҳуҷайраҳоро барқарор мекунад.паҳн кардан.Меристемаи реша.Мутобиқи ин, табобати KAND 11 миқдори аломати тақсимоти ҳуҷайраҳои CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ро дар меристемаи реша кам кард (расми 4e) 17.Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки KAND 11 афзоиши решаро тавассути коҳиш додани фаъолияти паҳншавии ҳуҷайраҳо бозмедорад.
Таҳлили таъсири ингибитори ҳосилаҳои кислотаи урбенонӣ (ҳосилаҳои урбенилокси) ба афзоиш.(а) Ниҳолҳои навъи ваҳшии 7-рӯзаи Col, ки дар лавҳаҳои MS бо консентратсияи нишондодаи KAND 11 парвариш карда шудаанд. Бари миқёс = 1 см.(б) Миқдори дарозии реша.Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (санҷиши Tukey HSD, саҳ<0,05).н>16. Маълумот ҳамчун миёна ± SD нишон дода шудааст.(в) Микроскопияи конфокалии решаҳои ваҳшӣ бо йодиди пропидиум оғушташуда, ки дар пластинаҳои MS бо 25 мкм КАНД ё бе он парвариш карда шудаанд 11. Қавсҳои сафед меристемаи решаро нишон медиҳанд.Сатри миқёс = 100 мкм.(г) Миқдори андозаи меристемаи реша (n = 10 то 11).Тафовутҳои оморӣ бо истифода аз t-test (саҳ<0,05).Барҳо андозаи миёнаи меристемаро ифода мекунанд.$E) микроскопи контрасти дифференсиалии интерференсиалии меристемаи реша, ки конструксияи CDKB2 дорад;1pro: CDKB2;1-GUS дар ниҳолҳои 5-рӯза, ки дар лавҳаҳои MS бо таҳлили 25 мкМ KAND парвариш карда шудаанд, ранг карда ва ранг карда шудааст.
Фитотоксик будани KAND 11 минбаъд бо истифода аз растании дусоҳаи дигар, тамоку (Nicotiana tabacum) ва организми асосии модели растании заминӣ, ҷигар (Marchantia polymorpha) санҷида шуд.Чун дар мавриди арабидопсис, нињоли тамокуи SR-1, ки дар муњити дорои 25 мкМ КАНД 11 парвариш карда шудааст, решањои кўтоњтар медињанд (расми 5а).Илова бар ин, аз 48 тухми 40-тоаш дар лавҳаҳои дорои 200 мкМ КАНД 11 сабзид, дар ҳоле ки ҳамаи 48 тухмиҳо дар муҳити сохтакорӣ сабзида буданд, ки ин нишон медиҳад, ки консентратсияи баланди KAND назаррас буд (с.<0,05;чи озмоиш -краббаъ) сабзиши тамокуро бозмедорад.(расми 5б).Илова бар ин, консентратсияи KAND 11, ки афзоиши бактерияҳоро дар ҷигар бозмедорад, ба консентратсияи муассир дар Арабидопсис монанд буд (расми 5c).Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки KAND 11 метавонад афзоиши растаниҳои гуногунро боздорад.Пас аз он мо ситотоксик будани эҳтимолии пайвастагиҳои моноамидҳои хирсро дар дигар организмҳо, аз ҷумла ҳуҷайраҳои HeLa-и инсон ва штамми Escherichia coli DH5α ҳамчун намояндагони ҳуҷайраҳои олии ҳайвонот ва бактерияҳо таҳқиқ кардем.Дар як қатор таҳлилҳои паҳншавии ҳуҷайраҳо, мо мушоҳида кардем, ки кумамонамид 1, кислотаи кумамонамидӣ 6 ва КАНД 11 ба афзоиши ҳуҷайраҳои HeLa ё E. coli дар консентратсияи 100 мкм таъсир намерасонанд (расми 5d, e).
Монеаи афзоиши KAND 11 дар организмҳои ғайриарабидопсис.(а) Ниҳолҳои тамокуи дуҳафтаинаи навъи ваҳшии SR-1 дар лавҳаҳои амудӣ ҷойгиршуда парвариш карда шуданд, ки дорои 25 μM KAND 11 мебошанд. (б) Ниҳолҳои тамокуи навъи SR-1 дар уфуқӣ ҷойгир карда шуданд. Пластинҳои MS, ки дорои 200 мкМ KAND 11 мебошанд. (в) Навдаи ҷигарбанди навъи дуҳафтаинаи ваҳшӣ Так-1, ки дар лавҳаҳои Gamborg B5 бо консентратсияи зикршудаи KAND 11 парвариш карда шудаанд. Тирҳои сурх спораҳоеро нишон медиҳанд, ки дар давоми инкубатсияи дуҳафта нашъунаморо қатъ кардаанд. давра.(г) Таҳлили паҳншавии ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои HeLa.Шумораи ҳуҷайраҳои қобили ҳаёт дар фосилаҳои муайяни вақт бо истифода аз маҷмӯаи ҳисобкунии ҳуҷайраҳои 8 (Dojindo) чен карда шуд.Ҳамчун назорат, ҳуҷайраҳои HeLa бо 5 мкг/мл актиномицин D (Act D) коркард карда шуданд, ки транскрипсияи РНК полимеразаро бозмедорад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад.Таҳлилҳо дар се нусха гузаронида шуданд.(д) Таҳлили паҳншавии ҳуҷайраҳои E. coli.Афзоиши E. coli тавассути ченкунии OD600 таҳлил карда шуд.Ҳамчун назорат, ҳуҷайраҳо бо 50 мкг/мл ампициллин (Amp) коркард карда шуданд, ки синтези девори ҳуҷайраи бактерияҳоро бозмедорад.Таҳлилҳо дар се нусха гузаронида шуданд.
Барои кушодани механизми амали ситотоксикӣ, ки аз пайвастагиҳои ба урамид алоқаманданд, мо ҳосилаҳои кислотаи урбениро бо таъсири мӯътадили ингибиторӣ дубора таҳлил кардем.чунон ки дар расм нишон дода шудааст.Тавре ки дар расмҳои 2b, 6a нишон дода шудааст, ниҳолҳое, ки дар лавҳаҳои агар дорои консентратсияи баланд (200 мкм) кислотаи урмотоникӣ 6 парвариш карда шудаанд, решаҳои кӯтоҳтар ва чап каҷ (θ = – 23,7 ± 6,1) ба вуҷуд меоранд, дар ҳоле ки ниҳолҳои дар муҳити назорат парваришшуда, нихолхо кариб решай рост хосил карданд (θ = – 3,8 ± 7,1).Маълум аст, ки ин афзоиши мобайнии хос аз дисфунксияи микротюбулҳои кортикалӣ ба амал меояд14,18.Мувофиқи ин бозёфт, доруҳои ноустуворкунандаи микротубула дизопирамид ва оризалин дар шароити афзоиши мо ба майнаи шабеҳи реша сабаб шуданд (расми 2б, 6а).Дар баробари ин, мо ҳосилаҳои кислотаи урмотоникро санҷида, якчандтои онҳоро интихоб кардем, ки дар консентратсияи муайян афзоиши решаи монеаро ба вуҷуд оварданд.Пайвастҳои 8, 9 ва 15 самти афзоиши решаро мутаносибан дар 75 μM, 50 μM ва 40 μM тағир доданд, ки нишон медиҳад, ки ин пайвастагиҳо метавонанд микротюбулҳоро ба таври муассир ноустувор созанд (расми 2б, 6а).Мо инчунин ҳосилаи пурқувваттарини кислотаи урсолии KAND 11-ро дар консентратсияи камтар (15 μM) озмоиш кардем ва дарёфтем, ки истифодаи KAND 11 афзоиши решаро бозмедорад ва самти афзоиши реша нобаробар аст, гарчанде ки онҳо майл ба тарафи чап нишеб мешуданд ( Расми C3)..Азбаски консентратсияи баландтари доруҳои микротубули ноустуворкунанда баъзан афзоиши растаниро бозмедорад, на ба каҷ шудани реша, мо баъдан имкони он ки KAND 11 тавассути мушоҳидаи микротубулҳои кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои эпидермалии реша ба микротубулҳо таъсир мерасонад, арзёбӣ кардем.Иммуногистохимия бо истифода аз антителоҳои зидди β-тубулин дар ҳуҷайраҳои эпидермалии решаҳои навниҳол, ки бо 25 мкм КАНД 11 коркард шудааст, нопадид шудани қариб ҳама микротубулаҳои кортикалии ҳуҷайраҳои эпидермалиро дар минтақаи дарозшавӣ нишон дод (расми 6б).Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки кислотаи кумамотонӣ ва ҳосилаҳои он мустақиман ё бавосита ба микротубулҳо таъсир мерасонанд ва онҳоро вайрон мекунанд ва ин пайвастагиҳо ингибиторҳои нави микротубул мебошанд.
Кислотаи урсоникӣ ва ҳосилаҳои он микротубулаҳои кортикалиро дар Arabidopsis thaliana тағир медиҳанд.(а) кунҷи майли реша дар ҳузури ҳосилаҳои гуногуни кислотаи урмотонӣ дар консентратсияи нишондодашуда чен карда мешавад.Таъсири ду пайвастагие, ки маълуманд, микротубулҳоро бозмедорад: дизопирамид ва оризалин низ таҳлил карда шуданд.Дар дохил стандарте нишон дода шудааст, ки барои чен кардани кунҷи афзоиши реша истифода мешавад.Ситорачаҳо фарқияти назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (ttest, саҳ<0,05).н>19. Сатри миқёс = 1 см.$B) Микротубулањои кортикали дар њуљайрањои эпидермалї дар минтаќаи дарозшавї.Микротубулҳо дар решаҳои навъи ваҳшии Arabidopsis Col, ки дар плитаҳои MS бо ё бе 25 μM KAND 11 парвариш карда шудаанд, тавассути рангкунии иммуногистохимикӣ бо истифода аз антителоҳои ибтидоии β-тубулин ва антителоҳои дуюмдараҷаи бо Alexa Fluor пайвастшуда визуалӣ карда шуданд.Сатри миқёс = 10 мкм.$C) Сохтори митозии микронайчањо дар меристемаи реша.Микротубулҳо бо истифода аз рангкунии иммуногистохимикӣ визуалӣ карда шуданд.Сохторҳои митозӣ, аз ҷумла минтақаҳои профаза, шпиндельҳо ва фрагмопластҳо, аз тасвирҳои конфокалӣ ҳисоб карда шуданд.Тирчаҳо сохторҳои микротубулаҳои митозиро нишон медиҳанд.Ситорачаҳо фарқияти назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (ttest, саҳ<0,05).н>9. Сатри миқёс = 50 мкм.
Гарчанде ки Ursa қобилияти вайрон кардани функсияи микротубулҳоро дорад, интизор меравад, ки механизми амали он аз агентҳои маъмулии деполимеризатсияи микротубулҳо фарқ кунад.Масалан, консентратсияи баландтари агентҳои деполимеризатсияи микротубулҳо ба монанди дизопирамид ва оризалин васеъшавии анизотропии ҳуҷайраҳои эпидермалиро ба вуҷуд меорад, дар ҳоле ки KAND 11 ин тавр намекунад.Илова бар ин, истифодаи муштараки KAND 11 ва дизопирамид боиси вокуниши омехтаи афзоиши решаи дизопирамид гардид ва ҷилавгирӣ аз афзоиши KAND 11 мушоҳида шуд (расми S4).Мо инчунин вокуниши мутантҳои ҳассоси дизопирамиди 1-1 (phs1-1) ба KAND 11-ро таҳлил кардем. phs1-1 дорои мутатсияи нуқтаи ғайриканоникии тубулинкиназа ва ҳангоми муолиҷа бо дизопирамид9,20 решаҳои кӯтоҳтар тавлид мекунад.Ниҳолҳои мутантии phs1-1, ки дар муҳити агар дорои KAND 11 парвариш карда шудаанд, решаҳои кӯтоҳтаре доштанд, ки дар дизопирамида парвариш карда шудаанд (расми S5).
Илова бар ин, мо дар меристемаи решаи ниҳолҳои бо KAND 11 коркардшуда сохторҳои микротюбулаҳои митозӣ, аз қабили минтақаҳои профаза, шпиндельҳо ва фрагмопластҳоро мушоҳида кардем. Бо мушоҳидаҳои CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, коҳиши назарраси микдори микронайчахои митозй мушохида карда шуд (расми .6в).
Барои тавсифи ситотоксик будани KAND 11 дар резолюцияи зерҳуҷайра, мо ҳуҷайраҳои суспензияи BY-2-и тамокуро бо KAND 11 коркард кардем ва аксуламали онҳоро мушоҳида кардем.Мо аввал KAND 11-ро ба ҳуҷайраҳои BY-2 илова кардем, ки TagRFP-TUA6-ро ифода мекунанд, ки микротубулҳоро флюоресцентӣ нишон медиҳанд, барои арзёбии таъсири KAND 11 ба микротубулаҳои кортикалӣ.Зичии микротубулҳои кортикалӣ бо истифода аз таҳлили тасвир арзёбӣ карда шуд, ки фоизи пикселҳои ситоскелетиро дар байни пикселҳои ситоплазмӣ муайян мекунад.Натиҷаҳои санҷиш нишон доданд, ки пас аз коркард бо 50 μM ё 100 μM KAND 11 дар тӯли 1 соат, зичии мутаносибан ба таври назаррас то 0,94 ± 0,74% ё 0,23 ± 0,28% коҳиш ёфт, дар ҳоле ки зичии ҳуҷайраҳои бо DMSO коркардшуда ± 10,6 ± 1,3 ± 1,3 ± 1,3 ± 1,6 ± 1,3 ± 1,6 ± 1,6 ± 1,3 ± 1,3 ро ташкил дод. % (расми 7а).Ин натиҷаҳо бо мушоҳидаи Арабидопсис мувофиқат мекунанд, ки табобати КАНД 11 боиси деполимеризатсияи микронайчаҳои кортикалӣ мегардад (расми 6б).Мо инчунин хати BY-2-ро бо филаментҳои актин бо нишони GFP-ABD пас аз коркард бо ҳамон консентратсияи KAND 11 тафтиш кардем ва мушоҳида кардем, ки коркарди KAND 11 риштаҳои актинро вайрон кардааст.Табобат бо 50 μM ё 100 μM KAND 11 барои 1 соат зичии филаментҳои актинро мутаносибан то 1,20 ± 0,62% ё 0,61 ± 0,26% коҳиш дод, дар ҳоле ки зичии ҳуҷайраҳои бо DMSO коркардшуда 1,69 ± 0,2% буд.7б).Ин натиҷаҳо бо таъсири пропизамид, ки ба филаментҳои актин таъсир намерасонанд ва латрункулин В, деполимеризатори актин, ки ба микротубулҳо таъсир намерасонанд, фарқ мекунанд (SI Тасвири S6).Илова бар ин, табобат бо кумамонамид 1, кислотаи кумамонамид 6 ё KAND 11 ба микротубулҳо дар ҳуҷайраҳои HeLa таъсир нарасонд (SI Тасвири S7).Ҳамин тариқ, механизми амали KAND 11 аз механизми вайронкунандагони маълуми ситоскелет фарқ мекунад.Илова бар ин, мушоҳидаи микроскопии ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 коркард шудааст, оғози марги ҳуҷайраҳоро ҳангоми муолиҷаи KAND 11 ошкор кард ва нишон дод, ки ҳиссаи ҳуҷайраҳои мурдаи кабуди кабуди Эванс пас аз 30 дақиқаи муолиҷаи KAND 11 ба таври назаррас афзоиш наёфтааст, дар ҳоле ки пас аз 90 дакикаи муолича бо 50 мкм ё 100 мкМ КАНД шумораи хучайрахои мурда мутаносибан ба 43,7 фоиз ё 80,1 фоиз афзуд (расми 7в).Якҷоя гирифта, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ҳосилшудаи кислотаи урсолии KAND 11 як ингибитори ситоскелетии ба растанӣ хос буда, механизми амали қаблан номаълум аст.
КАНД ба микротубулаҳои кортикалӣ, филаментҳои актинӣ ва қобилияти ҳаёти ҳуҷайраҳои BY-2 тамоку таъсир мерасонад.(а) Намоиши микротубулҳои кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои BY-2 дар ҳузури TagRFP-TUA6.Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 μM ё 100 μM) ё DMSO коркард шудаанд, тавассути микроскопияи конфокалӣ тафтиш карда шуданд.Зичии микротубулҳои кортикалӣ аз микрографҳои 25 ҳуҷайраи мустақил ҳисоб карда шуд.Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (санҷиши Tukey HSD, саҳ<0,05).Сатри миқёс = 10 мкм.(б) Филаментҳои актини кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои BY-2, ки дар ҳузури GFP-ABD2 тасвир шудаанд.Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 μM ё 100 μM) ё DMSO коркард шудаанд, тавассути микроскопияи конфокалӣ тафтиш карда шуданд.Зичии филаментҳои актинии кортикалӣ аз микрографҳои 25 ҳуҷайраи мустақил ҳисоб карда шуд.Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (санҷиши Tukey HSD, саҳ<0,05).Сатри миқёс = 10 мкм.(в) Мушоҳидаи ҳуҷайраҳои мурдаи BY-2 бо ранги кабуди Эванс.Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 μM ё 100 μM) ё DMSO коркард шудаанд, тавассути микроскопияи майдони равшан тафтиш карда шуданд.n=3.Сатри миқёс = 100 мкм.
Кашф ва ба кор бурдани махсулоти нави табий боиси пешравихои назаррас дар сохахои гуногуни хаёти инсон, аз чумла дар тиб ва хочагии кишлок гардид.Барои аз сарватхои табий ба даст овардани пайвастагихои фоиданок тадкикоти таърихй гузаронда шудааст.Махсусан, актиномицетҳо ҳамчун антибиотикҳои зидди паразитӣ барои нематодҳо аз сабаби қобилияти тавлиди метаболитҳои мухталифи дуюмдараҷа ба монанди авермектин, пайвастагии пешбари ивермектин ва блеомицин ва ҳосилаҳои он, ки дар доруворӣ ҳамчун агенти зидди саратон истифода мешаванд, муфиданд.Ба ин монанд, аз актиномицетҳо пайвастагиҳои гуногуни гербицид кашф карда шудаанд, ки баъзеи онҳо аллакай дар тиҷорат истифода мешаванд1,23.Аз ин рӯ, таҳлили метаболитҳои актиномицетҳо барои ҷудо кардани маҳсулоти табиӣ бо фаъолиятҳои биологии дилхоҳ стратегияи муассир ҳисобида мешавад.Дар ин тадкикот мо аз S. werraensis пайвастагии нав — кумамонамидро кашф карда, онро бомуваффакият синтез намудем.Кислотаи урсоникӣ мобайнии синтетикии урбенамид ва ҳосилаҳои он мебошад.Он метавонад гардиши хоси решаро ба вуҷуд орад, фаъолияти мӯътадил то қавӣ гербицидӣ нишон диҳад ва мустақим ё бавосита микротубулаҳои растанӣ осеб расонад.Аммо, механизми амали кислотаи урмотоникӣ метавонад аз механизми ингибиторҳои мавҷудаи микротубулҳо фарқ кунад, зеро KAND 11 инчунин филаментҳои актинро вайрон мекунад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад, ки механизми танзимкунандаро нишон медиҳад, ки тавассути он кислотаи урмотоник ва ҳосилаҳои он ба доираи васеи сохторҳои ситоскелетӣ таъсир мерасонанд..
Тавсифи минбаъдаи муфассали кислотаи урбенонӣ барои беҳтар фаҳмидани механизми амали кислотаи урбенонӣ кӯмак мекунад.Аз ҷумла, ҳадафи навбатӣ арзёбии қобилияти кислотаи урсонӣ барои пайвастшавӣ ба микротубулҳои коҳишёфта мебошад, то муайян кунад, ки оё кислотаи урсоникӣ ва ҳосилаҳои он мустақиман ба микротубулҳо амал мекунанд ва онҳоро деполимеризатсия мекунанд ё амали онҳо боиси ноустувории микротубулҳо мегардад.Илова бар ин, дар ҳолате, ки микротубулҳо ҳадафи мустақим нестанд, муайян кардани макони амал ва ҳадафҳои молекулавии кислотаи урсонӣ дар ҳуҷайраҳои растанӣ барои фаҳмидани хосиятҳои пайвастагиҳои алоқаманд ва роҳҳои имконпазири беҳтар кардани фаъолияти гербицидҳо кӯмак хоҳад кард.Таҳлили биоактивии мо қобилияти беҳамтои ситотоксикии кислотаи урсониро дар афзоиши растаниҳо ба монанди Arabidopsis thaliana, тамоку ва ҷигар нишон дод, дар ҳоле ки на E. coli ва на ҳуҷайраҳои HeLa таъсир нарасонданд.Заҳролудшавии кам ё тамоман ба ҳуҷайраҳои ҳайвонот бартарии ҳосилаҳои кислотаи урсонӣ мебошад, агар онҳо ҳамчун гербисидҳо барои истифода дар майдонҳои кушоди кишоварзӣ таҳия карда шаванд.Воқеан, азбаски микротубулҳо сохторҳои маъмул дар эукариотҳо мебошанд, ҷилавгирӣ аз интихоби онҳо дар растаниҳо талаботи калидӣ барои гербисидҳо мебошад.Масалан, пропизамид, як агенти деполимеризатсияи микротубул, ки бевосита ба тубулин мепайвандад ва полимеризатсияро бозмедорад, аз сабаби заҳролудшавии пасти он ба ҳуҷайраҳои ҳайвонот ҳамчун гербицид истифода мешавад24.Дар муқоиса бо дизопирамид, бензамидҳои марбута дорои хусусиятҳои гуногуни мақсаднок мебошанд.Илова ба микротубулаҳои растанӣ, RH-4032 ё бензоксамид низ мутаносибан микротубулаҳои ҳуҷайраҳои ҳайвонот ё омицетҳоро бозмедорад ва zalilamide аз сабаби фитотоксикӣ пасти он ҳамчун фунгисид истифода мешавад25,26,27.Хирс ва ҳосилаҳои нав кашфшуда бар зидди растаниҳо ситотоксикии интихобӣ нишон медиҳанд, аммо бояд қайд кард, ки тағиротҳои минбаъда метавонанд хусусияти ҳадафи онҳоро тағир диҳанд ва эҳтимолан ҳосилаҳои иловагиро барои мубориза бо занбӯруғҳои патогенӣ ё омицетҳо таъмин кунанд.
Хусусиятҳои беназири кислотаи урбенонӣ ва ҳосилаҳои он барои коркарди онҳо ҳамчун гербицид ва ҳамчун асбоби тадқиқотӣ истифода мешаванд.Аҳамияти ситоскелет дар идоракунии шакли ҳуҷайраҳои растанӣ ба таври васеъ эътироф шудааст.Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки растаниҳо механизмҳои мураккаби ташкили микротубулаҳои кортикалиро тавассути назорати динамикаи микротубулҳо барои дуруст назорат кардани морфогенез таҳия кардаанд.Миқдори зиёди молекулаҳое, ки барои танзими фаъолияти микротубулҳо масъуланд, муайян карда шудаанд ва таҳқиқоти марбута то ҳол идома дорад3,4,28.Фаҳмиши кунунии мо дар бораи динамикаи микротубулҳо дар ҳуҷайраҳои растанӣ механизмҳои ташкили микротубулаҳои кортикалиро пурра шарҳ намедиҳад.Масалан, гарчанде ки ҳам дизопирамид ва ҳам оризалин метавонанд микротубулҳоро деполимеризатсия кунанд, дизопирамид боиси таҳрифи шадиди реша мегардад, дар ҳоле ки оризалин таъсири нисбатан сабук дорад.Ғайр аз он, мутатсия дар тубулин, ки микротубулҳоро мӯътадил мегардонад, инчунин дар решаҳо декстроротатсияро ба вуҷуд меорад, дар ҳоле ки паклитаксел, ки динамикаи микротубулҳоро низ мӯътадил мекунад, ин тавр намекунад.Аз ин рӯ, омӯхтан ва муайян кардани ҳадафҳои молекулавии кислотаи урсолит бояд дар бораи танзими микротубулаҳои кортикалии растанӣ фаҳмиши нав диҳад.Ба ҳамин монанд, муқоисаи ояндаи кимиёвӣ, ки дар пешбурди афзоиши таҳрифшуда, ба монанди дизопирамид ва кимиёвии камсамар, ба монанди оризалин ё кислотаи кумамоторӣ самараноканд, нишон медиҳанд, ки чӣ гуна афзоиши таҳрифшуда рух медиҳад.
Аз тарафи дигар, таҷдиди ситоскелетҳои марбут ба дифоъ як имкони дигари фаҳмондани ситотоксикии кислотаи урсоникӣ мебошад.Сирояти микроорганизм ё ворид кардани элиситор ба ҳуҷайраҳои растанӣ баъзан боиси вайроншавии ситоскелет ва марги минбаъдаи ҳуҷайра мегардад29.Масалан, гузориш дода шудааст, ки криптоксантини аз омицет ҳосилшуда микротубулҳо ва филаментҳои актинро пеш аз марги ҳуҷайраҳои тамоку вайрон мекунад, ба он чизе ки бо табобати КАНД рух медиҳад30,31.Монандиҳо байни аксуламалҳои дифоъӣ ва аксуламалҳои ҳуҷайравӣ, ки аз кислотаи урсонӣ ба вуҷуд омадаанд, моро водор сохт, ки онҳо равандҳои умумии ҳуҷайраро ба вуҷуд меоранд, гарчанде ки таъсири тезтар ва қавии кислотаи урсоникӣ нисбат ба криптоксантин аён аст.Аммо, тадқиқотҳо нишон доданд, ки вайроншавии филаментҳои актин ба марги стихиявии ҳуҷайраҳо мусоидат мекунад, ки на ҳамеша бо вайроншавии микротюбулҳо ҳамроҳ мешавад29.Илова бар ин, бояд муайян карда шавад, ки оё патоген ё элиситор боиси афзоиши вайроншудаи реша мегардад, мисли ҳосилаҳои кислотаи урсоникӣ.Ҳамин тариқ, дониши молекулавӣ, ки ҷавобҳои муҳофизатӣ ва ситоскелетро мепайвандад, як мушкилоти ҷолибест, ки бояд ҳал карда шавад.Бо истифода аз мавҷудияти пайвастагиҳои вазни пасти молекулавии марбут ба кислотаи урсоникӣ, инчунин як қатор ҳосилаҳои дорои потенсиалҳои гуногун, онҳо метавонанд барои ҳадафи механизмҳои номаълуми ҳуҷайра имконият фароҳам оранд.
Якҷоя, кашф ва татбиқи пайвастагиҳои наве, ки динамикаи микротюбулҳоро моддӣ мекунанд, усулҳои пурқувватро барои ҳалли механизмҳои мураккаби молекулавӣ, ки дар асоси муайян кардани шакли ҳуҷайраҳои растанӣ ҷойгиранд, фароҳам меорад.Дар ин замина, кислотаи мураккаби урмотоникии ба наздикӣ таҳияшуда, ки ба микротубулҳо ва филаментҳои актин таъсир мерасонад ва марги ҳуҷайраҳоро ба вуҷуд меорад, метавонад имкон диҳад, ки робитаи байни назорати микротюбулҳо ва ин механизмҳои дигарро муайян кунад.Ҳамин тариқ, таҳлили кимиёвӣ ва биологӣ бо истифода аз кислотаи урбенонӣ ба мо дар фаҳмидани механизмҳои танзими молекулавӣ, ки ситоскелети растаниро назорат мекунанд, кӯмак мекунад.
S. werraensis MK493-CF1-ро ба зарфи 500 мл, ки дорои 110 мл муҳити тухмӣ иборат аст аз 2% (в/в) галактоза, 2% (в/в) хамираи эссенс, 1% (в/в) таркиби бакто дорад, эм кунед. .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) ҷуворимакка (KOGOSTCH Co., Ltd., Ҷопон), 0,2% (w/v) (NH4) 2SO4 ва 0,2% CaCO3 дар оби deionized.(рН 7.4 пеш аз стерилизатсия).Фарҳангҳои тухмӣ дар як шкалаи даврзананда (180 айн/дақ) дар ҳарорати 27°C барои 2 рӯз инкуб карда шуданд.Парвариши истеҳсолот тавассути ферментатсияи ҳолати сахт.Фарҳанги тухмӣ (7 мл) ба колбаи 500 мл K-1 гузаронида шуд, ки дорои 40 г муҳити истеҳсолӣ иборат аст аз 15 г ҷав прессшуда (MUSO Co., Ltd., Ҷопон) ва 25 г оби деионизатсияшуда (рН танзим карда нашудааст) пеш аз стерилизатсия).).Ферментатсия дар ҳарорати 30 ° C дар торикӣ барои 14 рӯз гузаронида мешавад.Маводи ферментатсия бо 40 мл / шиша EtOH истихроҷ карда шуд ва центрифуга карда шуд (1500 г, 4 ° C, 10 дақиқа).Маводи фарҳангӣ (60 мл) бо омехтаи 10% MeOH/EtOAc истихроҷ карда шуд.Қабати органикӣ дар зери фишори кам бухор карда шуд, то боқимонда (59,5 мг) ба даст оварда шавад, ки он ба HPLC бо элюсияи градиентӣ (0-10 дақиқа: 90%) дар сутуни марҳилаи баръакс (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID) дучор шуд. 10 мм × дарозӣ 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 дақиқа: 90% H2O/CH3CN то 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 дақиқа: 90% H2O/EtOH, 45–155 дақиқа: 90% H2O / EtOH ба 100% EtOH (градиент (градиент), 155-200 дақиқа: 100% EtOH) бо суръати ҷараёни 1,5 мл / дақ, кумамонамид (1, 36,0 мг) ҳамчун хокаи аморфӣ сафед ҷудо карда шуд.
Кумамотоамид (1);1H-NMR (500 МГс, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Гц, 1Н), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Гц 1Н), 6,05 (t, J = 3,8 Гц, 1Н).), 4,08 (с, 3Н);13C-NMR (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ арзиши ҳисобшуда: 141,0659, арзиши ченшуда: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 115 см.
Тухмиҳои Колумбия (Кол-0) аз Маркази захираҳои биологии Arabidopsis (ABRC) бо иҷозати истифодаи тадқиқот гирифта шудаанд.Тухмихои кол-0 дар шароити лаборатории мо парвариш ва нигохубин карда шуда, хамчун растанихои арабии вахшй истифода бурда шуданд.Тухмиҳои арабидопсис рӯизаминӣ стерилизатсия карда шуданд ва дар муҳити ниммустаҳками Мурашиге ва Скоог парвариш карда шуданд, ки дорои 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино) кислотаи этансульфонӣ (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) ва 1,5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, дар 23 °C ва нури доимӣ.Тухми муттанти phs1-1-ро Т Хашимото (Институти илм ва техникаи Нара) додааст.
Тухми штамм SR-1 аз ҷониби Т. Ҳашимото (Институти илм ва технологияи Нара) дода шуда, ҳамчун растании тамокуи ваҳшӣ истифода шудааст.Тухмиҳои тамоку дар сатҳи стерилизатсия карда шуданд ва дар давоми се шабонарӯз дар оби стерилизатсияшуда тар карда шуданд, то нашъунамо шаванд, сипас дар маҳлули нимқуввати дорои 2% сахароза, 0,05% (w/v) MES ва 0,8% резини геллан (Fujifilm Wako Pure Chemical) ҷойгир карда шуданд. Мурашиге.ва миёна Skoog) бо pH 5,7 ва дар 23 ° C дар зери нури доимӣ инкубатсия карда мешавад.
Штамми Так-1 аз ҷониби Т. Кохчи (Донишгоҳи Киото) пешниҳод шудааст ва ҳамчун воҳиди таҷрибавӣ барои омӯзиши ҷигар истифода шудааст.Гемма аз растаниҳои парваришшудаи стерилизатсияшуда ба даст оварда шуд ва сипас дар муҳити Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), ки дорои 1% сахароза ва 0,3% резини геллан аст ва дар ҳарорати 23 ° C дар зери нури доимӣ инкубатсия карда шуд.
Ҳуҷайраҳои тамоку BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) аз ҷониби С. Хасезава (университети Токио) таъмин карда шудаанд.Ҳуҷайраҳои BY-2 дар муҳити тағирёфтаи Linsmeier ва Skoog 95 маротиба илова карда шуданд ва ҳар ҳафта бо кислотаи 2,4-dichlorophenoxyacetic 32 илова карда шуданд.Суспензияи ҳуҷайра дар шеваи чархзананда дар 130 чархзанӣ дар 27 ° C дар торикӣ омехта карда шуд.Ҳуҷайраҳоро бо ҳаҷми 10 маротиба зиёдтар аз муҳити тару тоза бишӯед ва дар ҳамон муҳити атроф дубора суспенд кунед.Хатҳои ҳуҷайраи трансгении BY-2, ки мӯътадил ифодакунандаи маркери микротубули TagRFP-TUA6 ё маркери филаменти актини GFP-ABD2 дар зери промоутери вируси гулкарам 35S, тавре тавсиф шудааст, тавлид шуданд33,34,35.Ин хатҳои ҳуҷайраро бо истифода аз расмиёти шабеҳ ба хати ҳуҷайраҳои аслии BY-2 нигоҳ доштан ва ҳамоҳанг кардан мумкин аст.
Ҳуҷайраҳои HeLa дар муҳити тағирёфтаи Eagle's Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) парвариш карда шуданд, ки бо 10% хунобаи гови ҳомила, 1,2 U/мл пенициллин ва 1,2 мкг/мл стрептомицин дар инкубатори 37°C бо 5% CO2 илова карда шуданд.
Ҳама таҷрибаҳои дар ин дастнавис тавсифшуда мувофиқи қоидаҳо ва дастурҳои бехатарии биологии Ҷопон анҷом дода шуданд.
Пайвастагиҳо дар диметилсулфоксиди (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ҳамчун маҳлулҳои саҳҳомӣ гудохта шуда, дар муҳити MS барои Arabidopsis ва тамоку ё Gamborg B5 барои ҷигардор маҳлул карда шуданд.Барои таҳлили монеъшавии афзоиши реша, дар як лавҳа зиёда аз 10 тухмӣ дар муҳити агар, ки дорои пайвастагиҳои нишондодашуда ё DMSO мебошанд, кошта шуд.Тухмҳо дар камераи афзоиш барои 7 рӯз инкубатсия карда мешаванд.Нихолхо ба сурат гирифта, дарозии реша чен карда шуд.Барои таҳлили нашъунамои Арабидопсис, 48 тухмӣ дар як табақи агар дар муҳити агар дорои 200 мкМ пайвастаги ё DMSO кошта шуд.Тухми арабидопсис дар камераи нашъунамо парвариш карда шуда, шумораи нихолхои сабзидаро 7 руз пас аз нашъунамо (даг) ба хисоб гирифтанд.Барои санҷиши нашъунамои тамоку, 24 тухмӣ дар як пластинка дар муҳити агар, ки дорои 200 мкм КАНД ё DMSO мавҷуд аст, кошта шуд.Тухмии тамоку дар камераи нашъунамо парвариш карда шуда, пас аз 14 руз микдори нихолхои сабзида ба хисоб гирифта шуд.Барои таҳлили монеъшавии афзоиши ҷигар, 9 ҷанин аз ҳар як лавҳа ба муҳити агар дорои консентратсияи зикршудаи KAND ё DMSO гузошта шуда, дар камераи афзоиш барои 14 рӯз инкубатсия карда шуд.
Ниҳолҳои бо 5 мг/мл йодиди пропидиум (PI) ранг кардашударо истифода баред, то ташкили меристемаи решаро тасаввур кунед.Сигналҳои PI тавассути микроскопияи флуоресцентӣ бо истифода аз микроскопи сканерии лазерии конфокалии TCS SPE (Leica Microsystems) мушоҳида карда шуданд.
Рангкунии гистохимиявии решаҳо бо β-глюкуронидаза (GUS) мувофиқи протоколи тавсифкардаи Малами ва Бенфей36 анҷом дода шуд.Ниҳолҳо дар як шабонарӯз дар 90% ацетон ҷойгир карда шуда, бо 0,5 мг/мл 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-д-глюкурон дар буфери GUS барои 1 соат ранг карда шуда, дар маҳлули гидратшудаи хлоралдегид ҷойгир карда шуданд.(8 г хлоралгидрат, 2 мл об ва 1 мл глицерол) ва тавассути микроскопи контрасти дифференсиалии интерференсиалӣ бо истифода аз микроскопи Axio Imager M1 (Карл Зейсс) мушоҳида карда мешавад.
Кунҷи реша дар ниҳолҳои 7-рӯза, ки дар лавҳаҳои амудӣ ҷойгир карда шудаанд, чен карда шуданд.Кунҷи решаро аз самти вектори вазнинӣ тавре чен кунед, ки дар қадами 6 тавсиф шудааст.
Ҷойгиркунии микротубулҳои кортикалӣ тавре ки тавсиф карда шуд, бо тағиротҳои хурд ба протокол 37 мушоҳида карда шуд.Антителоҳои зидди β-тубулин (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ва Alexa Fluor 488-конъюгатшудаи зидди муш IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ҳамчун антителоҳои ибтидоӣ ва дуюмдараҷа дар 1:1000 ва 1:10, мутаносибан.Тасвирҳои флуоресцентӣ бо истифода аз микроскопи сканерии лазерии конфокалии TCS SPE (Leica Microsystems) ба даст оварда шуданд.Тасвирҳои Z-стекро ба даст оред ва мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда пешгӯиҳои максималии шиддатро эҷод кунед.
Таҳлили паҳншавии ҳуҷайраҳои HeLa бо истифода аз Kit Counting Cell 8 (Dojindo) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд.
Афзоиши E. coli DH5α тавассути чен кардани зичии ҳуҷайра дар фарҳанг бо истифода аз спектрофотометр дар 600 нм (OD600) таҳлил карда шуд.
Ташкили ситоскелетҳо дар ҳуҷайраҳои трансгении BY-2 бо истифода аз микроскопи флуоресцентӣ, ки бо дастгоҳи сканеркунии конфокалии CSU-X1 (Ёкогава) ва камераи sCMOS (Zyla, Andor Technology) муҷаҳҳаз шудааст, мушоҳида карда шуд.Зичии ситоскелетҳо тавассути таҳлили тасвир баҳо дода шуд, ки фоизи пикселҳои ситоскелетиро дар байни пикселҳои ситоплазмӣ дар тасвирҳои конфокалӣ бо истифода аз нармафзори ImageJ тавре тавсиф кардааст38,39 муайян кард.
Барои муайян кардани марги ҳуҷайраҳо дар ҳуҷайраҳои BY-2, як аликвоти суспензияи ҳуҷайра бо 0,05% Эванс кабуд барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуд.Рангҳои кабуди интихобии Эванс аз ҳуҷайраҳои мурда аз хориҷ кардани ранг аз ҳуҷайраҳои қобили ҳаёт тавассути мембранаи плазмаи солим вобаста аст40.Ҳуҷайраҳои рангшуда бо истифода аз микроскопи майдони равшан (BX53, Olympus) мушоҳида карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои HeLa дар DMEM бо 10% FBS дар инкубатори намнокшуда дар 37 ° C ва 5% CO2 парвариш карда шуданд.Ҳуҷайраҳо бо 100 мкМ КАНД 11, кислотаи кумамонамӣ 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колсемид (Гибко) ё 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) барои 6 соат дар 37 ° C коркард карда шуданд.Ҳуҷайраҳо бо MetOH барои 10 дақиқа ва сипас бо ацетат барои 5 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ мустаҳкам карда шуданд.Ҳуҷайраҳои собит бо антиденои ибтидоии β-тубулин (1D4A4, Proteintech: 66240-1) дар 0,5% BSA/PBS барои 2 соат маҳлул карда шуданд, 3 маротиба бо TBST шуста шуданд ва сипас бо антиденои буз Alexa Fluor инкубатсия карда шуданд.4881 соат.– Муш IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) ва 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) дар 0,5% BSA/PBS маҳлул карда шудааст.Пас аз шустани се маротиба бо TBST, ҳуҷайраҳои доғдор дар микроскопи инвертсионии Nikon Eclipse Ti-E мушоҳида карда шуданд.Тасвирҳо бо камераи хунукшудаи Hamamatsu ORCA-R2 CCD бо истифода аз нармафзори MetaMorph (Дастгоҳҳои молекулавӣ) гирифта шуданд.
Вақти фиристодан: июн-17-2024