Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои натиҷаҳои беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо версияи нави браузери худро истифода баред (ё Реҷаи Мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубсозӣ ё JavaScript нишон медиҳем.
Кашф ва истифодаи судманди маҳсулоти табиӣ метавонад ба беҳтар шудани ҳаёти инсон мусоидат кунад. Кимиёвии боздорандаи афзоиши растанӣ ба таври васеъ ҳамчун гербисидҳо барои мубориза бо алафҳои бегона истифода мешавад. Аз сабаби зарурати истифодаи намудҳои гуногуни гербисидҳо, зарурати муайян кардани пайвастагиҳо бо механизмҳои нави амал ба миён омадааст. Дар ин таҳқиқот, мо як пайвастагии нави N-алкоксипиррол, кумамонамидро аз Streptomyces werraensis MK493-CF1 кашф кардем ва раванди пурраи синтезро муқаррар кардем. Тавассути таҳлили фаъолияти биологӣ, мо кашф кардем, ки кислотаи урс-моноамид миёнарави синтетикии урс-моноамид ва эҳтимолан...ингибитори афзоиши растанӣИлова бар ин, мо ҳосилаҳои гуногуни кислотаи урбенониро таҳия кардем, аз ҷумла ҳосилаи урбенилокси (UDA), ки дорои фаъолияти баланди гербисидӣ буда, ба афзоиши ҳуҷайраҳои HeLa таъсири манфӣ мерасонад. Мо инчунин муайян кардем, ки ҳосилаҳои кислотаи урмотонӣ микронайчаҳои растаниро халалдор мекунанд; илова бар ин, KAND ба риштаҳои актин таъсир мерасонад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад; Ин таъсироти бисёрҷониба аз таъсири ингибиторҳои маъруфи микронайчаҳо фарқ мекунанд ва механизми нави амали кислотаи урсониро нишон медиҳанд, ки дар таҳияи гербисидҳои нав як бартарии муҳим аст.
Кашф ва татбиқи амалии маҳсулоти табиии муфид ва ҳосилаҳои онҳо воситаи беҳтар кардани сифати ҳаёти инсон аст. Метаболитҳои дуюмдараҷа, ки аз ҷониби микроорганизмҳо, растаниҳо ва ҳашарот истеҳсол мешаванд, боиси пешрафтҳои бузург дар тиб ва кишоварзӣ шудаанд. Аз маҳсулоти табиӣ бисёр антибиотикҳо ва доруҳои зидди лейкемия таҳия шудаанд. Илова бар ин, намудҳои гуногуни...пеститсидҳо, фунгисидҳо ва гербисидҳо аз ин маҳсулоти табиӣ барои истифода дар кишоварзӣ истихроҷ карда мешаванд. Аз ҷумла, гербисидҳои мубориза бо алафҳои бегона воситаҳои муҳим барои баланд бардоштани ҳосилнокии зироатҳо дар кишоварзии муосир мебошанд ва намудҳои гуногуни пайвастагиҳо аллакай ба таври тиҷорӣ истифода мешаванд. Якчанд равандҳои ҳуҷайравӣ дар растаниҳо, ба монанди фотосинтез, мубодилаи моддаҳои аминокислотаҳо, синтези девори ҳуҷайра, танзими митоз, сигнализатсияи фитогормон ё синтези сафедаҳо, ҳадафҳои маъмулии гербисидҳо ҳисобида мешаванд. Пайвастагиҳое, ки фаъолияти микронайчаҳоро бозмедоранд, як синфи маъмули гербисидҳо мебошанд, ки ба афзоиши растанӣ тавассути таъсир расонидан ба танзими митоз таъсир мерасонанд2.
Микронайчаҳо ҷузъҳои ситоскелетон мебошанд ва дар ҳуҷайраҳои эукариотӣ ба таври васеъ нигоҳ дошта мешаванд. Гетеродимери тубулин аз α-тубулин ва β-тубулин иборат аст, ки протофиламентҳои микронайчаҳои хаттиро ташкил медиҳанд ва 13 протофиламент сохтори силиндрӣ ташкил медиҳанд. Микронайчаҳо дар ҳуҷайраҳои растанӣ нақшҳои гуногунро мебозанд, аз ҷумла муайян кардани шакли ҳуҷайра, тақсимоти ҳуҷайра ва интиқоли дохилиҳуҷайравӣ3,4. Ҳуҷайраҳои растанӣ дорои микронайчаҳо дар зери мембранаи плазмавии байнифазавӣ мебошанд ва ин микронайчаҳои ба истилоҳ кортикалӣ ташкили микрофибрилҳои селлюлозаро тавассути танзими комплексҳои синтазаи селлюлоза4,5 назорат мекунанд. Микронайчаҳои кортикалии ҳуҷайраҳои эпидермалии реша, ки дар минтақаи дарозшавии босуръати нӯги реша мавҷуданд, дар паҳлӯ ҷойгиранд ва микронахҳои селлюлоза ин микронайчаҳоро пайгирӣ мекунанд ва самти васеъшавии ҳуҷайраро маҳдуд мекунанд ва бо ин васила дарозшавии анизотропии ҳуҷайраҳоро мусоидат мекунанд. Аз ин рӯ, вазифаи микронайчаҳо бо морфологияи растанӣ зич алоқаманд аст. Ивазшавии аминокислотаҳо дар генҳое, ки тубулинро рамзгузорӣ мекунанд, боиси каҷравии массивҳои микронайчаҳои қишрии кортикалӣ ва афзоиши чап ё рост дар Arabidopsis 6,7 мегардад. Ба ҳамин монанд, мутатсияҳо дар сафедаҳои марбут ба микронайчаҳо, ки динамикаи микронайчаҳоро танзим мекунанд, инчунин метавонанд ба афзоиши таҳрифшудаи реша оварда расонанд8,9,10,11,12,13. Илова бар ин, табобат бо гербисидҳое, ки микронайчаҳоро халалдор мекунанд, ба монанди дисопирамид, ки бо номи претилахлор низ маълум аст, инчунин боиси афзоиши решаи каҷ дар тарафи чап мегардад14. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки танзими дақиқи вазифаи микронайчаҳо барои муайян кардани самти афзоиши растанӣ муҳим аст.
Намудҳои гуногуни ингибиторҳои микротубула кашф карда шудаанд ва ин доруҳо саҳми назаррас дар таҳқиқоти ситоскелетикӣ, инчунин дар кишоварзӣ ва тиб гузоштаанд2. Аз ҷумла, пайвастагиҳои оризалин, динитроанилин, дизопирамид, пайвастагиҳои марбут ба бензамид ва аналогҳои онҳо метавонанд фаъолияти микротубуларо боздоранд ва бо ин васила афзоиши растаниро боздоранд. Аз ин рӯ, онҳо ба таври васеъ ҳамчун гербисидҳо истифода мешаванд. Аммо, азбаски микротубулаҳо ҷузъи муҳими ҳуҷайраҳои растанӣ ва ҳайвонот мебошанд, аксари ингибиторҳои микротубула барои ҳарду намуди ҳуҷайра ситотоксикӣ мебошанд. Аз ин рӯ, сарфи назар аз фоиданокии эътирофшудаи онҳо ҳамчун гербисидҳо, шумораи маҳдуди агентҳои зиддимикротубула барои мақсадҳои амалӣ истифода мешаванд.
Streptomyces як ҷинси оилаи Streptomyces аст, ки бактерияҳои аэробӣ, грам-мусбат ва ришташаклро дар бар мегирад ва бо қобилияти худ барои истеҳсоли доираи васеи метаболитҳои дуюмдараҷа машҳур аст. Аз ин рӯ, он яке аз муҳимтарин манбаъҳои маҳсулоти табиии нави биологӣ фаъол ҳисобида мешавад. Дар таҳқиқоти ҷорӣ, мо як пайвастагии наверо бо номи кумамонамид кашф кардем, ки аз Streptomyces werraensis MK493-CF1 ва S. werraensis ISP 5486 ҷудо карда шудааст. Бо истифода аз таҳлили спектрӣ ва таҳлили пурраи спектрӣ, сохтори кумамонамид тавсиф карда шуд ва скелети беназири N-алкоксипирроли он муайян карда шуд. синтез. Кислотаи урсмонӣ, як миёнарави синтетикии урсмоноамид ва ҳосилаҳои он, муайян карда шуд, ки афзоиш ва сабзиши растании модели маъмули Arabidopsis thaliana-ро бозмедорад. Дар як таҳқиқоти муносибатҳои сохтор ва фаъолият, мо муайян кардем, ки пайвастагие бо C9, ки ба кислотаи урсонӣ тағйир дода шудааст, ҳосилаи нонилоксии кислотаи урсонӣ (KAND) номида мешавад, таъсири боздорандаро ба афзоиш ва сабзиш ба таври назаррас афзоиш медиҳад. Қобили зикр аст, ки ингибитори нав кашфшудаи афзоиши растанӣ инчунин ба афзоиши тамоку ва ҷигар таъсир расонд ва барои бактерияҳо ё ҳуҷайраҳои HeLa ситотоксикӣ набуд. Ғайр аз ин, баъзе ҳосилаҳои кислотаи урмотонӣ фенотипи решаи таҳрифшударо ба вуҷуд меоранд, ки маънои онро дорад, ки ин ҳосилаҳо мустақиман ё бавосита ба микронайчаҳо таъсир мерасонанд. Мутобиқи ин идея, мушоҳидаҳои мо дар бораи микронайчаҳо, ки бо сафедаҳои иммуногистохимӣ ё флуоресцентӣ нишонгузорӣ шудаанд, нишон медиҳанд, ки табобати KAND микронайчаҳоро деполимеризатсия мекунад. Илова бар ин, табобат бо ҳосилаҳои кислотаи кумамотонӣ микрофиламентҳои актинро вайрон кард. Ҳамин тариқ, мо як ингибитори нави афзоиши растаниро кашф кардем, ки механизми беназири амали он нобудшавии ситоскелетро дар бар мегирад.
Штамми MK493-CF1 аз хок дар Шинагава-ку, Токио ҷудо карда шуд. Штамми MK493-CF1 митселияи стромалии хуб шохадорро ташкил дод. Пайдарпайии қисман гени РНК-и рибосомавии 16S (1422 bp) муайян карда шуд. Ин штамм ба S. werraensis хеле монанд аст (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: штамми маъмулӣ, 99.93%). Бар асоси ин натиҷа, муайян карда шуд, ки ин штамм бо штамми навъи S. werraensis зич алоқаманд аст. Аз ин рӯ, мо ин штаммро муваққатан S. werraensis MK493-CF1 номгузорӣ кардем. S. werraensis ISP 5486T низ ҳамон пайвастагиҳои биоактивиро истеҳсол мекунад. Азбаски таҳқиқоти ибтидоӣ дар бораи ба даст овардани маҳсулоти табиӣ аз ин микроорганизм кам буд, таҳқиқоти минбаъдаи кимиёвӣ гузаронида шуданд. Пас аз парвариши S. werraensis MK493-CF1 дар муҳити ҷав бо роҳи ферментатсияи ҳолати сахт дар ҳарорати 30°C ба муддати 14 рӯз, муҳити зист бо 50% EtOH экстракт карда шуд. 60 мл намуна хушк карда шуд, то 59,5 мг экстракт хом ба даст оварда шавад. Экстракт хом ба HPLC-и фазаи баръакс дучор карда шуд, то N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид (1, ки кумамонамид ном дорад, 36,0 мг) ба даст оварда шавад. Миқдори умумии 1 тақрибан 60% экстракт хомро ташкил медиҳад. Аз ин рӯ, мо тасмим гирифтем, ки хосиятҳои кумамотоамид 1-ро муфассал омӯзем.
Кумамонамид 1 хокаи аморфии сафед аст ва спектрометрияи массавии баландсифат (HRESIMS) C6H8N2O2-ро тасдиқ мекунад (Расми 1). Фрагменти пирроли ивазшудаи C2-и ин пайвастагӣ бо δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH дар спектри 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) ва δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) тавсиф мешавад ва спектри 13C NMR мавҷудияти чор атоми карбони sp2-ро нишон медиҳад. Мавҷудияти гурӯҳи амид дар мавқеи C2 бо роҳи коррелятсияи HMBC аз протони C-3 ба карбонили амид дар δC 161.1 арзёбӣ карда шуд. Илова бар ин, қуллаҳои 1H ва 13C NMR дар δH 4.10 (3H, S) ва δC 68.3 мавҷудияти гурӯҳҳои N-метоксиро дар молекула нишон медиҳанд. Гарчанде ки мавқеи дурусти гурӯҳи метокси ҳанӯз бо истифода аз таҳлили спектроскопӣ, ба монанди спектроскопияи фарқияти такмилёфта ва ихтисораи Overhauser Nuclear (NOEDF) муайян карда нашуда буд, N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид аввалин пайвастагии номзад гардид.
Барои муайян кардани сохтори дурусти 1, синтези умумӣ анҷом дода шуд (Расми 2a). Коркарди 2-аминопиридин 2, ки дар тиҷорат дастрас аст, бо m-CPBA боиси ҳосили миқдории мувофиқи N-оксид 3 гардид. Пас аз 2-аминоазидшавии 2, реаксияи сиклоконденция, ки аз ҷониби Абрамович тавсиф шудааст, дар бензол дар 90°C гузаронида шуд, то 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрили дилхоҳ 5 дар грамм ба даст оварда шавад. Суръат 60% (ду марҳила). 15,16. Метилизатсия ва гидролизи 4 сипас 1-метокси-1H-пиррол-2-кислотаи карбоксилӣ (кислотаи кумотонӣ номида мешавад, 6)-ро бо ҳосили хуб (70%, ду марҳила) дод. Ниҳоят, амидкунӣ тавассути миёнаравии хлориди кислота 6 бо истифода аз аммиаки обӣ ба Кумамото амид 1 бо ҳосили 98% дод. Ҳама маълумоти спектралии 1-и синтезшуда ба 1-и ҷудошуда монанд буданд, аз ин рӯ сохтори 1 муайян карда шуд;
Синтез ва таҳлили умумии фаъолияти биологии урбенамид ва кислотаи урбенӣ. (а) Синтези пурраи амид Кумамото. (б) Ниҳолҳои ҳафтрӯзаи ваҳшии Арабидопсис Колумбия (Col) дар табақчаҳои Мурашиге ва Скуг (MS), ки кумамонамид 6 ё кумамонамид 1-ро дар консентратсияҳои нишондодашуда дар бар мегирифтанд, парвариш карда шуданд. Миқёси рах = 1 см.
Аввалан, мо фаъолиятҳои биологии урбенамид ва миёнаравҳои онро аз рӯи қобилияти онҳо барои танзими афзоиши растанӣ арзёбӣ кардем. Мо ба муҳити MS агар консентратсияҳои гуногуни урсмонамид 1 ё кислотаи урсмонӣ 6 илова кардем ва ниҳолҳои Arabidopsis thaliana-ро дар ин муҳити зист парвариш кардем. Ин таҳлилҳо нишон доданд, ки консентратсияҳои баланди 6 (500 мкМ) афзоиши решаро бозмедорад (Расми 2б). Сипас, мо бо иваз кардани мавқеи N1-и 6 ҳосилаҳои гуногунро ба вуҷуд овардем ва таҳқиқоти робитаи сохтор-фаъолиятро дар онҳо анҷом додем (раванди синтези аналогӣ дар Маълумоти Ёрдамчӣ (SI) тавсиф шудааст). Ниҳолҳои Arabidopsis дар муҳити дорои 50 мкМ ҳосилаҳои кислотаи урсонӣ парвариш карда шуданд ва дарозии реша чен карда шуд, чунон ки дар расм нишон дода шудааст. Тавре ки дар расмҳои 3a, b ва S1 нишон дода шудааст, кислотаҳои кумамо дар мавқеи N1 дарозиҳои гуногуни занҷирҳои алкоксии хаттӣ (9, 10, 11, 12 ва 13) ё занҷирҳои калони алкокси (15, 16 ва 17) доранд. Ҳосилаҳо монеаи назарраси афзоиши решаро нишон доданд. Илова бар ин, мо муайян кардем, ки истифодаи 200 μM 10, 11 ё 17 сабзишро бозмедорад (Расми 3c ва S2).
Омӯзиши робитаи сохтор-фаъолияти амид Кумамото ва пайвастагиҳои марбут. (а) Сохтор ва схемаи синтези аналогҳо. (б) Муайян кардани дарозии решаи ниҳолҳои 7-рӯза, ки дар муҳити MS бо ҳосилаҳои 50 мкМ кумамонамид парвариш карда шудаанд. Ситорачаҳо фарқиятҳои назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (озмоиши t, p<0.05). n>18. Маълумот ҳамчун миёна ± SD нишон дода шудаанд. nt маънои "санҷида нашудааст"-ро дорад, зеро зиёда аз 50% тухмиҳо сабзида набаромадаанд. (c) Миқдори суръати сабзиши тухмиҳои коркардшуда, ки барои 7 рӯз дар муҳити MS бо ё бе 200 мкМ кумамонамид ва пайвастагиҳои марбут инкубатсия шудаанд. Ситорачаҳо фарқиятҳои назаррасро бо коркарди қалбакӣ (озмоиши хи-квадрат) нишон медиҳанд. n=96.
Ҷолиб он аст, ки илова кардани занҷирҳои паҳлӯии алкилӣ, ки аз C9 дарозтаранд, фаъолияти боздорандаро коҳиш дод ва нишон медиҳад, ки пайвастагиҳои марбут ба кислотаи кумамоой барои нишон додани фаъолияти биологии худ ба занҷирҳои паҳлӯии андозаи муайян ниёз доранд.
Азбаски таҳлили робитаи сохтор-фаъолият нишон дод, ки C9 ба кислотаи урсонӣ тағйир дода шудааст ва ҳосилаи ғайрилоксии кислотаи урсонӣ (минбаъд KAND 11 номида мешавад) самараноктарин ингибитори афзоиши растанӣ буд, мо тавсифи муфассалтари KAND 11-ро анҷом додем. Табобати Arabidopsis бо 50 мкМ KAND 11 қариб пурра аз сабзиш пешгирӣ кард, дар ҳоле ки консентратсияи пасттар (40, 30, 20 ё 10 мкМ) KAND 11 афзоиши решаро ба таври вобаста ба воя бозмедошт (Расми 4a, b). Барои санҷидани он, ки оё KAND 11 ба қобилияти зинда мондани меристемаи реша таъсир мерасонад, мо меристемаҳои решаро, ки бо йодиди пропидий (PI) ранг карда шудаанд, тафтиш кардем ва андозаи майдони меристемаро чен кардем. Андозаи меристемаи ниҳолҳо, ки дар муҳити дорои 25 мкМ KAND-11 парвариш карда шудаанд, 151,1 ± 32,5 мкм буд, дар ҳоле ки андозаи меристемаи ниҳолҳо, ки дар муҳити назоратӣ дорои DMSO мебошанд, 264,7 ± 30,8 мкм буд (Расми 4c, d), ки нишон медиҳад, ки KAND-11 фаъолияти ҳуҷайраро барқарор мекунад. паҳншавӣ. Меристемаи реша. Мувофиқи ин, табобати KAND 11 миқдори нишондиҳандаи тақсимоти ҳуҷайра CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-ро дар меристемаи реша кам кард (Расми 4e) 17. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки KAND 11 афзоиши решаро тавассути коҳиш додани фаъолияти афзоиши ҳуҷайра бозмедорад.
Таҳлили таъсири боздорандаи ҳосилаҳои кислотаи урбенонӣ (ҳосилаҳои урбенилокси) ба афзоиш. (а) Ниҳолҳои ваҳшии навъи 7-рӯзаи Col, ки дар лавҳаҳои MS бо консентратсияҳои нишондодашудаи KAND 11 парвариш карда шудаанд. Миқёси сатр = 1 см. (б) Миқдори дарозии реша. Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (озмоиши HSD Tukey, саҳ.<0.05). n>16. Маълумот ҳамчун миёна ± SD нишон дода шудаанд. (c) Микроскопияи конфокалии решаҳои ваҳшии навъи Col, ки бо йодиди пропидий ранг карда шудаанд, ки дар лавҳаҳои MS бо ё бе 25 мкМ KAND парвариш карда шудаанд. 11. Қавсҳои сафед меристемаи решаро нишон медиҳанд. Миқёси сатр = 100 мкм. (d) Миқдори андозаи меристемаи реша (n = 10 то 11). Тафовутҳои оморӣ бо истифода аз санҷиши t (p) муайян карда шуданд.<0.05). Сутунҳо андозаи миёнаи меристемаро нишон медиҳанд. (e) Микроскопияи контрасти интерференсиалии дифференсиалӣ (DIC)-и меристемаи реша, ки дорои сохтори CDKB2 мебошад; 1pro: CDKB2; 1-GUS ранг карда ва дар ниҳолҳои 5-рӯза, ки дар лавҳаҳои MS бо ё бе озмоиши 25 µM KAND парвариш карда шудаанд, ранг карда шудааст.
Фитотоксикии KAND 11 бо истифода аз як растании дупалладонаи дигар, тамоку (Nicotiana tabacum) ва як организми модели растании асосии заминӣ, ҷигарворт (Marchantia polymorpha) минбаъд санҷида шуд. Мисли Arabidopsis, ниҳолҳои тамокуи SR-1, ки дар муҳити дорои 25 мкМ KAND 11 парвариш карда шудаанд, решаҳои кӯтоҳтар ба вуҷуд оварданд (Расми 5а). Илова бар ин, 40 аз 48 тухм дар табақчаҳои дорои 200 мкМ KAND 11 сабзиданд, дар ҳоле ки ҳамаи 48 тухм дар муҳити коркардшудаи тақлидӣ сабзиданд, ки нишон медиҳад, ки консентратсияи баланди KAND назаррас буд (p<0.05; озмоиши хи - мураббаъ) сабзиши тамокуро бозмедошт. (Расми 5b). Илова бар ин, консентратсияи KAND 11, ки афзоиши бактерияҳоро дар ҷигарбанд бозмедошт, ба консентратсияи муассири Arabidopsis монанд буд (Расми 5c). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки KAND 11 метавонад афзоиши як қатор растаниҳоро боздорад. Сипас, мо ситотоксикии эҳтимолии пайвастагиҳои марбут ба моноамидҳои хирсро дар дигар организмҳо, яъне ҳуҷайраҳои HeLa-и инсон ва штамми Escherichia coli DH5α, ҳамчун намояндагони ҳуҷайраҳои ҳайвоноти олӣ ва бактериявӣ, таҳқиқ кардем. Дар як қатор санҷишҳои афзоиши ҳуҷайра, мо мушоҳида кардем, ки кумамонамид 1, кислотаи кумамонамид 6 ва KAND 11 ба афзоиши ҳуҷайраҳои HeLa ё E. coli дар консентратсияҳои 100 μM таъсир нарасонидаанд (Расми 5d,e).
Боздории афзоиши KAND 11 дар организмҳои ғайри Arabidopsis. (а) Ниҳолҳои тамокуи навъи ваҳшии SR-1, ки ду ҳафтаина доранд, дар табақчаҳои MS-и амудӣ ҷойгиршуда, ки дорои 25 мкМ KAND 11 буданд, парвариш карда шуданд. (б) Ниҳолҳои тамокуи навъи ваҳшии SR-1, ки ду ҳафтаина доранд, дар табақчаҳои MS-и уфуқӣ ҷойгиршуда, ки дорои 200 мкМ KAND 11 буданд, парвариш карда шуданд. (в) Навдаҳои ҷигарии навъи ваҳшии Tak-1, ки ду ҳафтаина доранд, ки дар табақчаҳои Gamborg B5 бо консентратсияҳои нишондодашудаи KAND 11 парвариш карда шудаанд. Тирҳои сурх спораҳоеро нишон медиҳанд, ки дар давраи инкубатсияи дуҳафтаина афзоишро қатъ кардаанд. (г) Санҷиши афзоиши ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои HeLa. Шумораи ҳуҷайраҳои зинда дар фосилаҳои муайяни вақт бо истифода аз маҷмӯаи ҳисобкунии ҳуҷайраҳо 8 (Dojindo) чен карда шуд. Ҳамчун назорати ҳуҷайраҳои HeLa бо 5 мкг/мл актиномицин D (Act D) коркард карда шуданд, ки транскрипсияи полимеразаи РНК-ро бозмедорад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад. Таҳлилҳо се маротиба анҷом дода шуданд. (д) Санҷиши афзоиши ҳуҷайраҳои E. coli. Афзоиши E. coli бо роҳи чен кардани OD600 таҳлил карда шуд. Ҳамчун гурӯҳи назоратӣ, ҳуҷайраҳо бо 50 мкг/мл ампициллин (Amp) коркард карда шуданд, ки синтези девори ҳуҷайраҳои бактериявиро бозмедорад. Таҳлилҳо се маротиба гузаронида шуданд.
Барои кушодани механизми таъсири ситотоксикии аз пайвастагиҳои марбут ба урамид ба вуҷуд омада, мо ҳосилаҳои кислотаи урбениро бо таъсири мӯътадили боздоранда аз нав таҳлил кардем, чунон ки дар расм нишон дода шудааст. Тавре ки дар расмҳои 2b, 6a нишон дода шудааст, ниҳолҳое, ки дар лавҳаҳои агар-агар парвариш карда шудаанд, ки дорои консентратсияи баланди (200 μM) кислотаи урмотонӣ 6 мебошанд, решаҳои кӯтоҳтар ва чап-каҷ (θ = – 23.7 ± 6.1) ба вуҷуд оварданд, дар ҳоле ки ниҳолҳои дар муҳити назорат парваришёфта, ниҳолҳо решаҳои қариб рост (θ = – 3.8 ± 7.1) ба вуҷуд оварданд. Маълум аст, ки ин афзоиши хоси майл дар натиҷаи вайроншавии микронайчаҳои кортикалӣ ба вуҷуд меояд14,18. Мувофиқи ин бозёфт, доруҳои дисопирамид ва оризалин, ки микронайчаҳоро ноустувор мекунанд, майли монанд ба решаро дар шароити афзоиши мо ба вуҷуд оварданд (Расми 2b, 6a). Ҳамзамон, мо ҳосилаҳои кислотаи урмотониро санҷида, якчандтои онҳоро интихоб кардем, ки дар консентратсияҳои муайян афзоиши решаи майлро ба вуҷуд оварданд. Пайвастагиҳои 8, 9 ва 15 самти афзоиши решаро мутаносибан дар 75 мкМ, 50 мкМ ва 40 мкМ тағйир доданд, ки ин нишон медиҳад, ки ин пайвастагиҳо метавонанд микронайчаҳоро самаранок ноустувор гардонанд (Расми 2б, 6а). Мо инчунин пурқувваттарин ҳосилаи кислотаи урсолӣ, KAND 11-ро, дар консентратсияи пасттар (15 мкМ) озмоиш кардем ва муайян кардем, ки истифодаи KAND 11 афзоиши решаро бозмедорад ва самти афзоиши реша нобаробар аст, гарчанде ки онҳо майл ба майл ба чап доранд (Расми C3). Азбаски консентратсияи баланди доруҳои ноустувори микронайчаҳо баъзан афзоиши растаниро бозмедоранд, на боиси майли реша, мо баъдан имкони таъсир расонидани KAND 11 ба микронайчаҳоро тавассути мушоҳидаи микронайчаҳои кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои эпидермалии реша арзёбӣ кардем. Иммуногистохимия бо истифода аз антителоҳои зидди β-тубулин дар ҳуҷайраҳои эпидермалии решаҳои ниҳолҳо, ки бо 25 μM KAND 11 коркард шудаанд, нишон дод, ки нопадидшавии қариб ҳамаи микротубулаҳои қишрии ҳуҷайраҳои эпидермалӣ дар минтақаи дарозшавӣ (Расми 6b) мушоҳида шудааст. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки кислотаи кумамотонӣ ва ҳосилаҳои он мустақиман ё ғайримустақим ба микротубулаҳо таъсир мерасонанд, то онҳоро халалдор кунанд ва ин пайвастагиҳо ингибиторҳои нави микротубулаҳо мебошанд.
Кислотаи урсонӣ ва ҳосилаҳои он микронайчаҳои қишриро дар Arabidopsis thaliana тағйир медиҳанд. (а) Кунҷи майли реша, ки дар ҳузури ҳосилаҳои гуногуни кислотаи урмотонӣ дар консентратсияҳои нишондодашуда чен карда шудааст. Таъсири ду пайвастагие, ки микронайчаҳоро бозмедоранд: дизопирамид ва оризалин низ таҳлил карда шуданд. Дар варақ стандарте нишон дода шудааст, ки барои чен кардани кунҷи афзоиши реша истифода мешавад. Ситорачаҳо фарқиятҳои назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (озмоиши t, p<0.05). n>19. Хатти миқёс = 1 см. (б) Микронайчаҳои қишрӣ дар ҳуҷайраҳои эпидермалӣ дар минтақаи дарозшавӣ. Микронайчаҳо дар решаҳои навъи ваҳшии Arabidopsis Col, ки дар лавҳаҳои MS бо ё бе 25 мкМ KAND 11 парвариш карда шудаанд, бо рангкунии иммуногистохимӣ бо истифода аз антителоҳои ибтидоии β-тубулин ва антителоҳои дуюмдараҷаи бо Alexa Fluor пайвастшуда тасвир карда шуданд. Хатти миқёс = 10 мкм. (в) Сохтори митозӣ дар меристемаи реша. Микронайчаҳо бо истифода аз рангкунии иммуногистохимӣ тасвир карда шуданд. Сохторҳои митозӣ, аз ҷумла минтақаҳои профаза, шпинделҳо ва фрагмопластҳо, аз тасвирҳои конфокалӣ ҳисоб карда шуданд. Тирҳо сохторҳои микронайчаҳои митозӣ нишон медиҳанд. Ситорачаҳо фарқиятҳои назаррасро бо табобати қалбакӣ нишон медиҳанд (озмоиши t, p<0.05). n>9. Андозаи хати миқёс = 50 µm.
Гарчанде ки Ursa қобилияти халалдор кардани функсияи микронайчаҳоро дорад, интизор меравад, ки механизми амали он аз агентҳои маъмулии деполимеризатсияи микронайчаҳо фарқ кунад. Масалан, консентратсияи баланди агентҳои деполимеризатсияи микронайчаҳо, ба монанди дисопирамид ва оризалин, васеъшавии анизотропии ҳуҷайраҳои эпидермалиро ба вуҷуд меорад, дар ҳоле ки KAND 11 ин корро намекунад. Илова бар ин, истифодаи якҷояи KAND 11 ва дисопирамид боиси вокуниши якҷояи афзоиши реша аз дисопирамид ва боздории афзоиш аз KAND 11 гардид (Расми S4). Мо инчунин вокуниши мутанти дисопирамид 1-1 (phs1-1)-и ҳассоси баландро ба KAND 11 таҳлил кардем. phs1-1 дорои мутацияи нуқтаи киназаи ғайриканонӣ мебошад ва ҳангоми коркард бо дизопирамид9,20 решаҳои кӯтоҳтар ба вуҷуд меорад. Ниҳолҳои мутанти phs1-1, ки дар муҳити агари дорои KAND 11 парвариш карда шудаанд, решаҳои кӯтоҳтаре доштанд, ки ба онҳое, ки дар дисопирамид парвариш карда шудаанд, монанд буданд (расми S5).
Илова бар ин, мо дар меристемаи решаи ниҳолҳои бо KAND 11 коркардшуда сохторҳои микронайчаҳои митозиро, ба монанди минтақаҳои профаза, шпиндельҳо ва фрагмопластҳоро мушоҳида кардем. Мувофиқи мушоҳидаҳо барои CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, коҳиши назарраси шумораи микронайчаҳои митозиро мушоҳида кардем (Расми .6c).
Барои тавсифи ситозоксидии KAND 11 дар ҳалли зерҳуҷайравӣ, мо ҳуҷайраҳои суспензияи BY-2-и тамокуро бо KAND 11 коркард кардем ва вокуниши онҳоро мушоҳида кардем. Мо аввал KAND 11-ро ба ҳуҷайраҳои BY-2, ки TagRFP-TUA6-ро ифода мекунанд, ки микронайчаҳоро флуоресцентӣ нишон медиҳанд, илова кардем, то таъсири KAND 11-ро ба микронайчаҳои қишрӣ арзёбӣ кунем. Зичии микронайчаҳои қишрӣ бо истифода аз таҳлили тасвирҳо арзёбӣ карда шуд, ки фоизи пикселҳои ситоскелетро дар байни пикселҳои ситоплазмавӣ муайян кард. Натиҷаҳои таҳлил нишон доданд, ки пас аз табобат бо 50 мкМ ё 100 мкМ KAND 11 барои 1 соат, зичӣ ба таври назаррас мутаносибан ба 0,94 ± 0,74% ё 0,23 ± 0,28% коҳиш ёфт, дар ҳоле ки зичии ҳуҷайраҳои бо DMSO коркардшуда 1,61 ± 0,34% -ро ташкил дод (Расми 7а). Ин натиҷаҳо бо мушоҳида дар Arabidopsis мувофиқанд, ки табобати KAND 11 боиси деполимеризатсияи микронайчаҳои қишрии бадан мегардад (Расми 6б). Мо инчунин хати BY-2-ро бо риштаҳои актинии бо GFP-ABD нишонгузорӣшуда пас аз коркард бо ҳамон консентратсияи KAND 11 таҳқиқ кардем ва мушоҳида кардем, ки табобати KAND 11 риштаҳои актинро халалдор мекунад. Коркард бо 50 мкМ ё 100 мкМ KAND 11 барои 1 соат зичии риштаи актинро мутаносибан ба 1,20 ± 0,62% ё 0,61 ± 0,26% коҳиш дод, дар ҳоле ки зичии ҳуҷайраҳои коркардшудаи DMSO 1,69 ± 0,51% буд (Расми 2). 7б). Ин натиҷаҳо бо таъсири пропизамид, ки ба риштаҳои актин таъсир намерасонад ва латрункулин B, деполимеризатори актин, ки ба микронайчаҳо таъсир намерасонад, муқоиса мешаванд (SI Расми S6). Илова бар ин, табобат бо кумамонамид 1, кислотаи кумамонамид 6 ё KAND 11 ба микронайчаҳо дар ҳуҷайраҳои HeLa таъсир нарасонд (SI Расми S7). Ҳамин тариқ, механизми амали KAND 11 аз механизми вайронкунандагони маълуми ситоскелет фарқ мекунад. Илова бар ин, мушоҳидаи микроскопии мо дар бораи ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 табобат карда шуданд, оғози марги ҳуҷайраҳоро ҳангоми табобати KAND 11 нишон дод ва нишон дод, ки таносуби ҳуҷайраҳои мурдаи бо ранги кабуд рангкардашудаи Эванс пас аз 30 дақиқаи табобати KAND 11 ба таври назаррас афзоиш наёфтааст, дар ҳоле ки пас аз 90 дақиқаи табобат бо 50 μM ё 100 μM KAND, шумораи ҳуҷайраҳои мурда мутаносибан то 43,7% ё 80,1% афзоиш ёфтааст (Расми 7c). Дар маҷмӯъ, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ҳосилаи нави кислотаи урсолӣ KAND 11 як ингибитори ситоскелети мушаххаси растанӣ бо механизми қаблан номаълуми амал мебошад.
KAND ба микронайчаҳои кортикалӣ, риштаҳои актин ва қобилияти зинда мондани ҳуҷайраҳои BY-2-и тамоку таъсир мерасонад. (а) Тасаввур кардани микронайчаҳои кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои BY-2 дар ҳузури TagRFP-TUA6. Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 μM ё 100 μM) ё DMSO коркард шудаанд, бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ тафтиш карда шуданд. Зичии микронайчаҳои кортикалӣ аз микрографҳои 25 ҳуҷайраҳои мустақил ҳисоб карда шуд. Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (озмоиши Tukey HSD, саҳ.<0.05). Миқёси сатр = 10 µm. (b) Филаментҳои актинии кортикалӣ дар ҳуҷайраҳои BY-2, ки дар ҳузури GFP-ABD2 дида мешаванд. Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 µM ё 100 µM) ё DMSO коркард шудаанд, бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ тафтиш карда шуданд. Зичии филаментҳои актинии кортикалӣ аз микрографҳои 25 ҳуҷайраҳои мустақил ҳисоб карда шуд. Ҳарфҳо фарқиятҳои назаррасро нишон медиҳанд (озмоиши HSD Tukey, саҳ.<0.05). Хати миқёс = 10 µm. (c) Мушоҳидаи ҳуҷайраҳои мурдаи BY-2 бо рангкунии кабуди Эванс. Ҳуҷайраҳои BY-2, ки бо KAND 11 (50 µM ё 100 µM) ё DMSO коркард шудаанд, бо истифода аз микроскопияи майдони равшан тафтиш карда шуданд. n=3. Хати миқёс = 100 µm.
Кашф ва татбиқи маҳсулоти нави табиӣ боиси пешрафтҳои назаррас дар ҷанбаҳои гуногуни ҳаёти инсон, аз ҷумла тиб ва кишоварзӣ гардид. Тадқиқоти таърихӣ барои ба даст овардани пайвастагиҳои муфид аз захираҳои табиӣ гузаронида шудаанд. Аз ҷумла, маълум аст, ки актиномицетҳо ҳамчун антибиотикҳои зиддипаразитӣ барои нематодҳо муфиданд, зеро онҳо қобилияти истеҳсоли метаболитҳои дуюмдараҷаи гуногун, ба монанди авермектин, пайвастагии пешбари ивермектин ва блеомицин ва ҳосилаҳои онро доранд, ки ҳамчун агенти зидди саратон истифода мешаванд21,22. Ба ҳамин монанд, аз актиномицетҳо як қатор пайвастагиҳои гербисидӣ кашф карда шудаанд, ки баъзе аз онҳо аллакай дар тиҷорат истифода мешаванд1,23. Аз ин рӯ, таҳлили метаболитҳои актиномицетҳо барои ҷудо кардани маҳсулоти табиӣ бо фаъолиятҳои биологии дилхоҳ стратегияи муассир ҳисобида мешавад. Дар ин таҳқиқот, мо як пайвастагии нав, кумамонамидро аз S. werraensis кашф кардем ва онро бомуваффақият синтез кардем. Кислотаи урсонӣ як миёнаравии синтетикии урбенамид ва ҳосилаҳои он мебошад. Он метавонад боиси печидани хоси реша гардад, фаъолияти мӯътадил ё қавӣ гербисидӣ нишон диҳад ва мустақиман ё бавосита ба микронайчаҳои растанӣ зарар расонад. Аммо, механизми таъсири кислотаи урмотонӣ метавонад аз механизми ингибиторҳои мавҷудаи микротубулаҳо фарқ кунад, зеро KAND 11 инчунин филаминҳои актинро вайрон мекунад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад, ки ин механизми танзимкунандаеро нишон медиҳад, ки тавассути он кислотаи урмотонӣ ва ҳосилаҳои он ба доираи васеи сохторҳои ситоскелета таъсир мерасонанд.
Тавсифи муфассали минбаъдаи кислотаи урбенонӣ барои беҳтар фаҳмидани механизми таъсири кислотаи урбенонӣ кӯмак мекунад. Аз ҷумла, ҳадафи навбатӣ арзёбии қобилияти кислотаи урсонӣ барои пайвастшавӣ ба микронайчаҳои редуксияшуда барои муайян кардани он аст, ки оё кислотаи урсонӣ ва ҳосилаҳои он мустақиман ба микронайчаҳо таъсир мерасонанд ва онҳоро деполимеризатсия мекунанд ё оё амали онҳо боиси ноустувории микронайчаҳо мегардад. Илова бар ин, дар ҳолате, ки микронайчаҳо ҳадафи мустақим нестанд, муайян кардани макони таъсир ва ҳадафҳои молекулавии кислотаи урсонӣ дар ҳуҷайраҳои растанӣ барои фаҳмидани хосиятҳои пайвастагиҳои марбут ва роҳҳои имконпазири беҳтар кардани фаъолияти гербисидӣ кӯмак мекунад. Таҳлили биоактивии мо қобилияти беназири ситотоксикии кислотаи урсониро ба афзоиши растаниҳо ба монанди Arabidopsis thaliana, тамоку ва ҷигар ошкор кард, дар ҳоле ки на ҳуҷайраҳои E. coli ва на HeLa таъсир нарасонданд. Заҳролудшавии кам ё тамоман ба ҳуҷайраҳои ҳайвонот бартарии ҳосилаҳои кислотаи урсонӣ мебошад, агар онҳо ҳамчун гербисидҳо барои истифода дар майдонҳои кушоди кишоварзӣ таҳия карда шаванд. Дар ҳақиқат, азбаски микронайчаҳо сохторҳои маъмулӣ дар эукариотҳо мебошанд, боздории интихобии онҳо дар растаниҳо талаботи калидӣ барои гербисидҳо мебошад. Масалан, пропизамид, агенти деполимеризатсиякунандаи микронайчаҳо, ки мустақиман ба тубулин пайваст мешавад ва полимеризатсияро бозмедорад, ҳамчун гербисид аз сабаби заҳролудии пасти он ба ҳуҷайраҳои ҳайвонот истифода мешавад24. Бар хилофи дисопирамид, бензамидҳои марбут хосиятҳои гуногуни ҳадаф доранд. Илова бар микронайчаҳои растанӣ, RH-4032 ё бензоксамид инчунин мутаносибан микронайчаҳои ҳуҷайраҳои ҳайвонот ё омумисетҳоро бозмедорад ва залиламид аз сабаби фитотоксикии пасти он ҳамчун фунгисид истифода мешавад25,26,27. Хирси нав кашфшуда ва ҳосилаҳои он нисбат ба растаниҳо ситотоксикии интихобӣ нишон медиҳанд, аммо бояд қайд кард, ки тағйироти минбаъда метавонанд хосиятҳои ҳадафи онҳоро тағйир диҳанд ва эҳтимолан ҳосилаҳои иловагӣ барои назорати занбӯруғҳои патогенӣ ё омумисетҳоро таъмин кунанд.
Хусусиятҳои беназири кислотаи урбенонӣ ва ҳосилаҳои он барои таҳияи онҳо ҳамчун гербисидҳо ва истифода ҳамчун воситаҳои тадқиқотӣ муфиданд. Аҳамияти ситоскелет дар назорати шакли ҳуҷайраҳои растанӣ ба таври васеъ эътироф шудааст. Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки растаниҳо механизмҳои мураккаби ташкили микронайчаҳои қишриро тавассути назорати динамикаи микронайчаҳо барои назорати дурусти морфогенез таҳаввул додаанд. Шумораи зиёди молекулаҳое, ки барои танзими фаъолияти микронайчаҳо масъуланд, муайян карда шудаанд ва таҳқиқоти марбут ба онҳо то ҳол идома дорад3,4,28. Фаҳмиши кунунии мо дар бораи динамикаи микронайчаҳо дар ҳуҷайраҳои растанӣ механизмҳои ташкили микронайчаҳои қишриро пурра шарҳ намедиҳад. Масалан, гарчанде ки ҳам дизопирамид ва ҳам оризалин метавонанд микронайчаҳоро деполимеризатсия кунанд, дизопирамид боиси таҳрифи шадиди реша мегардад, дар ҳоле ки оризалин таъсири нисбатан сабук дорад. Ғайр аз ин, мутатсияҳо дар тубулин, ки микронайчаҳоро устувор мекунад, инчунин боиси декстроротатсия дар решаҳо мешаванд, дар ҳоле ки паклитаксел, ки инчунин динамикаи микронайчаҳоро устувор мекунад, чунин намекунад. Аз ин рӯ, омӯзиш ва муайян кардани ҳадафҳои молекулавии кислотаи урсолӣ бояд фаҳмиши наверо дар бораи танзими микронайчаҳои қишрии растанӣ фароҳам оварад. Ба ҳамин монанд, муқоисаи ояндаи моддаҳои кимиёвӣ, ки дар мусоидат ба афзоиши таҳрифшуда, ба монанди дисопирамид, ва моддаҳои кимиёвии камтар самаранок, ба монанди оризалин ё кислотаи кумамоторӣ, нишонаҳоеро дар бораи он ки чӣ гуна афзоиши таҳрифшуда ба амал меояд, фароҳам меорад.
Аз тарафи дигар, тағйироти ситоскелетии марбут ба дифоъ имконияти дигари шарҳ додани ситозоксидии кислотаи урсонӣ мебошанд. Сироятёбии патоген ё ворид кардани элиситор ба ҳуҷайраҳои растанӣ баъзан боиси нобудшавии ситоскелети ҳуҷайра ва марги минбаъдаи он мегардад29. Масалан, гузориш дода шудааст, ки криптоксантини аз омусит ҳосилшуда пеш аз марги ҳуҷайраҳои тамоку микронайчаҳо ва риштаҳои актинро вайрон мекунад, ки ба он чизе монанд аст, ки ҳангоми табобати KAND рух медиҳад30,31. Монандиҳо байни вокунишҳои дифоъӣ ва вокунишҳои ҳуҷайравӣ, ки аз ҷониби кислотаи урсонӣ ба вуҷуд омадаанд, моро водор карданд, ки фарзия кунем, ки онҳо равандҳои маъмулии ҳуҷайраро ба вуҷуд меоранд, гарчанде ки таъсири тезтар ва қавитари кислотаи урсонӣ нисбат ба криптоксантин аён аст. Бо вуҷуди ин, таҳқиқот нишон доданд, ки вайроншавии риштаҳои актин боиси марги стихиявии ҳуҷайра мегардад, ки на ҳамеша бо вайроншавии микронайчаҳо ҳамроҳ мешавад29. Илова бар ин, бояд дид, ки оё патоген ё элиситор боиси афзоиши таҳрифшудаи реша мешаванд, чунон ки ҳосилаҳои кислотаи урсонӣ мекунанд. Ҳамин тариқ, дониши молекулавӣ, ки вокунишҳои дифоъӣ ва ситоскелетро мепайвандад, як мушкили ҷолибест, ки бояд ҳал карда шавад. Бо истифода аз мавҷудияти пайвастагиҳои вазни молекулавии паст, ки ба кислотаи урсонӣ алоқаманданд, инчунин як қатор ҳосилаҳо бо потенсиалҳои гуногун, онҳо метавонанд имкониятҳоро барои ҳадаф қарор додани механизмҳои номаълуми ҳуҷайра фароҳам оваранд.
Дар маҷмӯъ, кашф ва татбиқи пайвастагиҳои наве, ки динамикаи микронайчаҳоро танзим мекунанд, усулҳои пуриқтидорро барои ҳалли механизмҳои мураккаби молекулавӣ, ки асоси муайян кардани шакли ҳуҷайраҳои растанӣ мебошанд, фароҳам меорад. Дар ин замина, пайвастагии ба наздикӣ таҳияшудаи кислотаи урмотонӣ, ки ба микронайчаҳо ва риштаҳои актин таъсир мерасонад ва боиси марги ҳуҷайра мегардад, метавонад имконият фароҳам орад, ки робитаи байни назорати микронайчаҳо ва ин механизмҳои дигарро кушояд. Ҳамин тариқ, таҳлили кимиёвӣ ва биологӣ бо истифода аз кислотаи урбенонӣ ба мо кӯмак мекунад, ки механизмҳои танзимкунандаи молекулавиро, ки ситоскелети растаниро назорат мекунанд, дарк кунем.
S. werraensis MK493-CF1-ро ба колбаи 500 мл-и Эрленмейер, ки дорои 110 мл муҳити тухмӣ мебошад, ки аз 2% (w/v) галактоза, 2% (w/v) хамираи эссенс, 1% (w/v) таркиби Bacto иборат аст, ворид кунед. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) экстракти ҷуворимакка (KOGOSTCH Co., Ltd., Ҷопон), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ва 0.2% CaCO3 дар оби деионизатсияшуда (рН 7.4 пеш аз стерилизатсия) истифода шудааст. Культураҳои тухмӣ дар як ҷунбиши гардишкунанда (180 чархзанӣ) дар ҳарорати 27°C барои 2 рӯз инкубатсия карда шуданд. Парвариши истеҳсолӣ тавассути ферментатсияи ҳолати сахт. Культураи тухмӣ (7 мл) ба колбаи 500 мл K-1, ки дорои 40 г муҳити истеҳсолӣ буд, ки аз 15 г ҷав (MUSO Co., Ltd., Ҷопон) ва 25 г оби деионизатсияшуда (рН пеш аз стерилизатсия танзим нашудааст) иборат буд, интиқол дода шуд. Ферментатсия дар ҳарорати 30°C дар торикӣ ба муддати 14 рӯз гузаронида шуд. Маводи ферментатсия бо 40 мл/шиша EtOH истихроҷ карда шуд ва сентрифуга карда шуд (1500 г, 4°C, 10 дақиқа). Қисми болоии кишт (60 мл) бо омехтаи 10% MeOH/EtOAc истихроҷ карда шуд. Қабати органикӣ таҳти фишори пастшуда бухор карда шуд, то боқимонда (59.5 мг) ба даст оварда шавад, ки он дар сутуни фазаи баръакс (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × дарозӣ 250 мм) ба HPLC бо элюсияи градиентӣ (0–10 дақиқа: 90%) дучор карда шуд. H2O/CH3CN, 10–35 дақиқа: 90% H2O/CH3CN то 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 дақиқа: 90% H2O/EtOH, 45–155 дақиқа: 90% H2O/EtOH то 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 дақиқа: 100% EtOH) бо суръати ҷараёни 1.5 мл/дақ, кумамонамид (1,36.0 мг) ҳамчун хокаи аморфии сафед ҷудо карда шуд.
Кумамотоамид(1); 1H-NMR (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Гц, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ арзиши ҳисобшуда: 141.0659, арзиши ченшуда: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Тухмиҳои Колумбия (Col-0) аз Маркази захираҳои биологии Arabidopsis (ABRC) бо иҷозат барои истифодаи тадқиқотӣ гирифта шуданд. Тухмиҳои Col-0 дар шароити лаборатории мо парвариш ва нигоҳдорӣ карда шуданд ва ҳамчун растаниҳои ваҳшии Arabidopsis истифода шуданд. Тухмиҳои Arabidopsis дар сатҳи стерилизатсия ва дар муҳити нимқуввати Мурашиге ва Скоог, ки дорои 2% сахароза (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфонӣ кислота (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical)) ва 1.5% агар (Fujifilm Wako Pure Chemical), рН 5.7, дар ҳарорати 23 °C ва нури доимӣ буданд, парвариш карда шуданд. Тухмиҳои мутанти phs1-1 аз ҷониби Т. Хашимото (Институти илм ва технологияи Нара) таъмин карда шуданд.
Тухмиҳои штамми SR-1 аз ҷониби Т. Ҳашимото (Институти илм ва технологияи Нара) пешниҳод карда шуданд ва ҳамчун растаниҳои тамокуи навъи ваҳшӣ истифода шуданд. Тухмиҳои тамоку рӯи замин стерилизатсия карда шуданд ва барои беҳтар кардани сабзиш се шаб дар оби стерилизатсияшуда тар карда шуданд, сипас дар маҳлули нимқувват, ки дорои 2% сахароза, 0.05% (w/v) MES ва 0.8% резини геллан (муҳити Fujifilm Wako Pure Chemical) Мурашиге ва Skoog) бо рН 5.7 буд, ҷойгир карда шуданд ва дар ҳарорати 23°C зери нури доимӣ инкубатсия карда шуданд.
Штамми Tak-1 аз ҷониби Т. Кохчи (Донишгоҳи Киото) пешниҳод карда шуд ва ҳамчун воҳиди стандартии таҷрибавӣ барои омӯзиши ҷигар истифода шуд. Ҷемма аз растаниҳои парваришёфтаи стерилизатсияшуда гирифта шуд ва сипас ба муҳити Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), ки дорои 1% сахароза ва 0,3% геллан резини буд, пӯшонида шуд ва дар ҳарорати 23°C зери нури пайваста инкубатсия карда шуд.
Ҳуҷайраҳои тамокуи BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) аз ҷониби С. Хасезава (Донишгоҳи Токио) пешниҳод карда шуданд. Ҳуҷайраҳои BY-2 дар муҳити тағйирёфтаи Линсмейер ва Скуг 95 маротиба об карда шуда, ҳар ҳафта бо кислотаи 2,4-дихлорфеноксиасетикӣ 32 илова карда шуданд. Суспензияи ҳуҷайра дар як ҷунбиши гардишкунанда бо суръати 130 чархзанӣ дар ҳарорати 27°C дар торикӣ омехта карда шуд. Ҳуҷайраҳо бо ҳаҷми 10 маротиба зиёдтар аз муҳити тару тоза бишӯед ва дар ҳамон муҳити дубора суспензия кунед. Хатҳои ҳуҷайраҳои трансгении BY-2, ки маркери микронайчаҳои TagRFP-TUA6 ё маркери филаменти актин GFP-ABD2-ро дар зери промоутери вируси мозаикаи гулкарам 35S устувор ифода мекунанд, тавре ки тавсиф шудааст33,34,35 тавлид карда шуданд. Ин хатҳои ҳуҷайраро метавон бо истифода аз расмиёти монанд ба онҳое, ки барои хати аслии ҳуҷайраҳои BY-2 истифода мешаванд, нигоҳ дошт ва ҳамоҳанг кард.
Ҳуҷайраҳои HeLa дар муҳити тағйирёфтаи Eagle's-и Дулбекко (DMEM) (Life Technologies), ки бо 10% зардоби гови ҷанинӣ, 1.2 U/ml пенициллин ва 1.2 мкг/мл стрептомицин дар инкубатори 37°C бо 5% CO2 илова карда шудааст, парвариш карда шуданд.
Ҳамаи таҷрибаҳои дар ин дастнавис тавсифшуда мутобиқи қоидаҳо ва дастурҳои бехатарии биологии Ҷопон анҷом дода шуданд.
Таркибҳо дар диметил сулфоксид (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ҳамчун маҳлулҳои захиравӣ ҳал карда шуда, дар муҳити MS барои Arabidopsis ва тамоку ё муҳити Gamborg B5 барои ҷигар ҳал карда шуданд. Барои санҷиши боздоштани афзоиши реша, зиёда аз 10 тухмӣ дар як табақча дар муҳити агар, ки дорои пайвастагиҳои нишондодашуда ё DMSO буд, кошта шуданд. Тухмҳо дар камераи афзоиш барои 7 рӯз инкубатсия карда шуданд. Ниҳолҳо аксбардорӣ карда шуданд ва дарозии решаҳо чен карда шуданд. Барои санҷиши сабзиши Arabidopsis, 48 тухмӣ дар як табақча дар муҳити агар, ки дорои пайвастагии 200 мкМ ё DMSO буд, кошта шуданд. Тухмиҳои Arabidopsis дар камераи афзоиш парвариш карда шуданд ва шумораи ниҳолҳои сабзида 7 рӯз пас аз сабзидан (даг) ҳисоб карда шуданд. Барои санҷиши сабзиши тамоку, 24 тухмӣ дар як табақча дар муҳити агар, ки дорои 200 мкМ KAND ё DMSO буд, кошта шуданд. Тухмиҳои тамоку дар камераи афзоиш парвариш карда шуданд ва шумораи ниҳолҳои сабзида пас аз 14 рӯз ҳисоб карда шуданд. Барои санҷиши боздории афзоиши ҷигар, 9 эмбрион аз ҳар як лавҳа ба муҳити агар, ки дорои консентратсияҳои нишондодашудаи KAND ё DMSO буд, пӯшонида шуда, дар камераи афзоиш ба муддати 14 рӯз инкубатсия карда шуданд.
Барои тасаввур кардани сохтори меристемаи реша, ниҳолҳои бо йодиди 5 мг/мл пропидий (PI) рангкардашударо истифода баред. Сигналҳои PI тавассути микроскопияи флуоресцентӣ бо истифода аз микроскопи сканкунии лазерии конфокалии TCS SPE (Leica Microsystems) мушоҳида карда шуданд.
Рангкунии гистохимиявии решаҳо бо β-глюкуронидаза (GUS) мувофиқи протоколе, ки аз ҷониби Малами ва Бенфей36 тавсиф шудааст, анҷом дода шуд. Ниҳолҳо шабона дар 90% ацетон фиксатсия карда шуданд, бо 0,5 мг/мл 5-бромо-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуронӣ кислота дар буфери GUS ба муддати 1 соат ранг карда шуданд ва дар маҳлули хлордегиди гидратшуда (8 г хлоргидрат, 2 мл об ва 1 мл глицерин) ҷойгир карда шуданд ва бо истифода аз микроскопияи контрасти интерференсиалӣ бо истифода аз микроскопи Axio Imager M1 (Carl Zeiss) мушоҳида карда шуданд.
Кунҷҳои реша дар ниҳолҳои 7-рӯза, ки дар табақчаҳои амудӣ ҷойгиршуда парвариш карда шудаанд, чен карда шуданд. Кунҷи решаро аз самти вектори ҷозиба, тавре ки дар қадами 6 тавсиф шудааст, чен кунед.
Тартиби микротубулаҳои кортикалӣ, тавре ки тавсиф шудааст, бо тағйироти ночиз ба протоколи 37 мушоҳида карда шуд. Антителои зидди β-тубулин (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ва IgG-и зидди муш бо Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) ҳамчун антителоҳои аввалия ва дуюмдараҷа бо маҳлулҳои 1:1000 ва 1:100 мутаносибан истифода шуданд. Тасвирҳои флуоресценсия бо истифода аз микроскопи сканерии лазерии конфокалии TCS SPE (Leica Microsystems) ба даст оварда шуданд. Тасвирҳои Z-стекро мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда ба даст оред ва проексияҳои максималии шиддатро эҷод кунед.
Санҷиши афзоиши ҳуҷайраҳои HeLa бо истифода аз маҷмӯаи ҳисобкунии ҳуҷайраҳо 8 (Dojindo) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд.
Афзоиши E. coli DH5α бо роҳи чен кардани зичии ҳуҷайраҳо дар кишт бо истифода аз спектрофотометр дар 600 нм (OD600) таҳлил карда шуд.
Сохтори ситоскелети ҳуҷайраҳои трансгении BY-2 бо истифода аз микроскопи флуоресцентӣ, ки бо дастгоҳи сканкунии конфокалии CSU-X1 (Yokogawa) ва камераи sCMOS (Zyla, Andor Technology) муҷаҳҳаз шудааст, мушоҳида карда шуд. Зичии ситоскелети тавассути таҳлили тасвир арзёбӣ карда шуд, ки фоизи пикселҳои ситоскелетиро дар байни пикселҳои ситоплазмавӣ дар тасвирҳои конфокалӣ бо истифода аз нармафзори ImageJ, ки тавсиф шудааст, муайян кард38,39.
Барои муайян кардани марги ҳуҷайраҳо дар ҳуҷайраҳои BY-2, як қисми суспензияи ҳуҷайра бо 0,05% кабуди Эванс барои 10 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуд. Рангкунии интихобӣ бо кабуди Эванси ҳуҷайраҳои мурда аз экструзияи ранг аз ҳуҷайраҳои зинда тавассути мембранаи плазмавии солим вобаста аст40. Ҳуҷайраҳои рангшуда бо истифода аз микроскопи майдони равшан (BX53, Olympus) мушоҳида карда шуданд.
Ҳуҷайраҳои HeLa дар DMEM, ки бо 10% FBS дар инкубатори намнокшуда дар ҳарорати 37°C ва 5% CO2 илова карда шудааст, парвариш карда шуданд. Ҳуҷайраҳо бо 100 мкМ KAND 11, кислотаи кумамонамикӣ 6, кумамонамид 1, 100 нг/мл колсемид (Gibco) ё 100 нг/мл Нокодмаз (Sigma) ба муддати 6 соат дар ҳарорати 37°C коркард карда шуданд. Ҳуҷайраҳо бо MetOH ба муддати 10 дақиқа ва сипас бо ацетат ба муддати 5 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ фиксатсия карда шуданд. Ҳуҷайраҳои фиксатсияшуда бо антителои ибтидоии β-тубулин (1D4A4, Proteintech: 66240-1), ки дар 0,5% BSA/PBS барои 2 соат омехта карда шудааст, инкубатсия карда шуданд, 3 маротиба бо TBST шуста шуданд ва сипас бо антителои бузи Alexa Fluor инкубатсия карда шуданд. 488 1 соат. – IgG-и муш (Thermo Fisher Scientific: A11001) ва 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) дар 0.5% BSA/PBS омехта карда шудааст. Пас аз се маротиба шустан бо TBST, ҳуҷайраҳои рангкардашуда дар микроскопи чаппашудаи Nikon Eclipse Ti-E мушоҳида карда шуданд. Тасвирҳо бо камераи CCD-и хунукшудаи Hamamatsu ORCA-R2 бо истифода аз нармафзори MetaMorph (Molecular Devices) гирифта шуданд.
Вақти нашр: 17 июни соли 2024