Афзоиши меристемаи апикалии навда (SAM) барои сохтори поя муҳим аст. Гормонҳои растанӣгиббереллинҳо(GAs) дар ҳамоҳангсозии афзоиши растанӣ нақши калидӣ мебозанд, аммо нақши онҳо дар SAM то ҳол ба таври кофӣ омӯхта нашудааст. Дар ин ҷо, мо биосенсори нисбатометрии сигнализатсияи GA-ро тавассути муҳандисии сафедаи DELLA барои пахш кардани вазифаи асосии танзимкунандаи он дар вокуниши транскриптсионалии GA таҳия кардем ва дар айни замон вайроншавии онро ҳангоми шинохти GA нигоҳ медорем. Мо нишон медиҳем, ки ин биосенсори асоси вайроншавӣ тағйиротро дар сатҳи GA ва ҳассосияти ҳуҷайра ҳангоми рушд дақиқ сабт мекунад. Мо ин биосенсорро барои харитасозии фаъолияти сигнализатсияи GA дар SAM истифода бурдем. Мо нишон медиҳем, ки сигналҳои баланди GA асосан дар ҳуҷайраҳое мавҷуданд, ки дар байни узвҳои аввал ҷойгиранд, ки пешгузаштагони ҳуҷайраҳои байнигиреҳҳо мебошанд. Бо истифода аз равишҳои фоида ва аз даст додани функсия, мо минбаъд нишон медиҳем, ки GA самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайраро танзим мекунад ва созмони каноникии ҳуҷайравии байнигиреҳҳоро муқаррар мекунад ва бо ин васила мушаххасоти байнигиреҳҳоро дар SAM пеш мебарад.
Меристемаи апикалии навда (SAM), ки дар нӯги навда ҷойгир аст, дорои як нишаи ҳуҷайраҳои бунёдӣ мебошад, ки фаъолияти онҳо узвҳои паҳлӯӣ ва гиреҳҳои пояро ба таври модулӣ ва такрорӣ дар тӯли ҳаёти растанӣ ба вуҷуд меорад. Ҳар яке аз ин воҳидҳои такроршаванда, ё гиреҳҳои растанӣ, гиреҳҳои байниқабатӣ ва узвҳои паҳлӯиро дар гиреҳҳо ва меристемаҳои зериқабатро дар зериқабати баргҳо дар бар мегирад1. Афзоиш ва ташкили гиреҳҳои растанӣ ҳангоми рушд тағйир меёбад. Дар Арабидопсис, афзоиши байниқабатӣ дар марҳилаи вегетативӣ боздошта мешавад ва меристемаҳои зериқабат дар зериқабати баргҳои розетка дар ҳолати хоболудӣ мемонанд. Дар давраи гузариш ба марҳилаи гулкунӣ, SAM ба меристемаи гул табдил меёбад, ки байниқабатҳои дароз ва навдаҳои зериқабат, шохачаҳо дар зериқабати баргҳои гулдор ва баъдтар гулҳои бебаргро ба вуҷуд меорад2. Гарчанде ки мо дар фаҳмидани механизмҳое, ки пайдоиши баргҳо, гулҳо ва шохаҳоро назорат мекунанд, пешрафти назаррас ба даст овардаем, дар бораи чӣ гуна пайдо шудани байниқабатҳо маълумоти нисбатан кам мавҷуд аст.
Фаҳмидани тақсимоти фазоӣ-замонии GA-ҳо барои беҳтар фаҳмидани вазифаҳои ин гормонҳо дар бофтаҳои гуногун ва дар марҳилаҳои гуногуни рушд кӯмак мекунад. Тасаввур кардани таназзули омезиши RGA-GFP, ки таҳти таъсири промоутери худи он ифода ёфтааст, маълумоти муҳимро дар бораи танзими сатҳи умумии GA дар решаҳо медиҳад15,16. Аммо, ифодаи RGA дар бофтаҳо17 фарқ мекунад ва аз ҷониби GA18 танзим карда мешавад. Ҳамин тариқ, ифодаи дифференсиалии промоутери RGA метавонад боиси он гардад, ки бо RGA-GFP намунаи флуоресценсия мушоҳида мешавад ва аз ин рӯ, ин усул миқдорӣ нест. Ба наздикӣ, GA19,20-и флуоресцеини биоактивӣ, ки бо Fl (Fl) нишонгузорӣ шудааст, ҷамъшавии GA-ро дар эндокортекси реша ва танзими сатҳи ҳуҷайравии онро тавассути интиқоли GA ошкор кард. Ба наздикӣ, сенсори GA FRET nlsGPS1 нишон дод, ки сатҳи GA бо дарозшавии ҳуҷайраҳо дар решаҳо, риштаҳо ва гипокотилҳои торикшуда21 алоқаманд аст. Аммо, тавре ки мо дидем, консентратсияи GA ягона параметре нест, ки фаъолияти сигнализатсияи GA-ро назорат мекунад, зеро он аз равандҳои мураккаби ҳассоскунӣ вобаста аст. Дар ин ҷо, бо такя ба фаҳмиши худ дар бораи роҳҳои сигнализатсияи DELLA ва GA, мо таҳия ва тавсифи биосенсори нисбатометрии таназзулро барои сигнализатсияи GA гузориш медиҳем. Барои таҳияи ин биосенсори миқдорӣ, мо аз RGA-и мутантии ҳассос ба GA, ки ба сафедаи флуоресцентӣ омехта шудааст ва дар бофтаҳо ба таври васеъ ифода ёфтааст, инчунин аз сафедаи флуоресцентии ҳассос ба GA истифода бурдем. Мо нишон медиҳем, ки омезиши сафедаҳои RGA-и мутант ҳангоми ифодаи ба таври васеъ ифодашуда ба сигнализатсияи эндогении GA халал намерасонанд ва ин биосенсор метавонад фаъолияти сигнализатсияро, ки дар натиҷаи вуруди GA ва коркарди сигнали GA аз ҷониби дастгоҳи ҳассоскунӣ бо қарори баланди фазоӣ-вақтӣ ба вуҷуд меояд, миқдорӣ муайян кунад. Мо ин биосенсорро барои харитасозии тақсимоти фазоӣ-вақтии фаъолияти сигнализатсияи GA ва муайян кардани он, ки чӣ гуна GA рафтори ҳуҷайравиро дар эпидермиси SAM танзим мекунад, истифода бурдем. Мо нишон медиҳем, ки GA самти ҳамвории тақсимоти ҳуҷайраҳои SAM-ро, ки дар байни узвҳои аввал ҷойгиранд, танзим мекунад ва бо ин васила сохтори каноникии ҳуҷайравии интергиреҳро муайян мекунад.
Дар ниҳоят, мо пурсидем, ки оё qmRGA метавонад тағйиротро дар сатҳи эндогении GA бо истифода аз гипокотилҳои афзоянда гузориш диҳад. Мо қаблан нишон додем, ки нитрат афзоишро тавассути афзоиши синтези GA ва дар навбати худ, вайроншавии DELLA34 ҳавасманд мекунад. Мувофиқан, мо мушоҳида кардем, ки дарозии гипокотил дар ниҳолҳои pUBQ10::qmRGA, ки дар зери таъминоти фаровони нитрат (10 мМ NO3−) парвариш карда шудаанд, нисбат ба ниҳолҳое, ки дар шароити норасоии нитрат парвариш карда шудаанд, ба таври назаррас дарозтар буд (Расми иловагии 6a). Мувофиқи вокуниши афзоиш, сигналҳои GA дар гипокотилҳои ниҳолҳое, ки дар шароити 10 мМ NO3− парвариш карда шудаанд, нисбат ба ниҳолҳое, ки дар набудани нитрат парвариш карда шудаанд, баландтар буданд (Расми иловагии 6б, в). Ҳамин тариқ, qmRGA инчунин имкон медиҳад, ки тағйирот дар сигнализатсияи GA, ки аз ҷониби тағйироти эндогенӣ дар консентратсияи GA ба вуҷуд омадаанд, назорат карда шаванд.
Барои фаҳмидани он, ки оё фаъолияти сигнализатсияи GA, ки аз ҷониби qmRGA муайян карда шудааст, аз консентратсияи GA ва дарки GA вобаста аст, тавре ки интизор мерафт, дар асоси тарҳи сенсор, мо ифодаи се ретсептори GID1-ро дар бофтаҳои растанӣ ва репродуктивӣ таҳлил кардем. Дар ниҳолҳо, хати гузоришгари GID1-GUS нишон дод, ки GID1a ва c дар тухмдонҳо хеле ифода ёфтаанд (Расми 3a–c). Илова бар ин, ҳар се ретсептор дар баргҳо, решаҳои паҳлӯӣ, нӯги реша (ба истиснои сарпӯши решаи GID1b) ва системаи рагҳо ифода ёфтаанд (Расми 3a–c). Дар SAM гулдаста, мо сигналҳои GUS-ро танҳо барои GID1b ва 1c муайян кардем (Расми иловагӣ 7a–c). Гибридизатсияи in situ ин намунаҳои ифодаро тасдиқ кард ва минбаъд нишон дод, ки GID1c дар сатҳҳои паст дар SAM яксон ифода ёфтааст, дар ҳоле ки GID1b ифодаи баландтарро дар канори SAM нишон дод (Расми иловагӣ 7d–l). Омезиши транслятсионии pGID1b::2xmTQ2-GID1b инчунин диапазони дараҷабандишудаи ифодаи GID1b-ро нишон дод, аз ифодаи паст ё набудани он дар маркази SAM то ифодаи баланд дар сарҳадҳои узвҳо (Расми иловагӣ 7m). Ҳамин тариқ, ретсепторҳои GID1 дар тамоми бофтаҳо ва дар дохили онҳо яксон тақсим нашудаанд. Дар таҷрибаҳои минбаъда, мо инчунин мушоҳида кардем, ки ифодаи аз ҳад зиёди GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ҳассосияти qmRGA-ро дар гипокотилҳо ба татбиқи берунаи GA афзоиш додааст (Расми 3d, e). Баръакс, флуоресценсия, ки бо qd17mRGA дар гипокотил чен карда шудааст, ба табобати GA3 ҳассос набуд (Расми 3f, g). Барои ҳарду таҳлил, ниҳолҳо бо консентратсияи баланди GA (100 μM GA3) коркард карда шуданд, то рафтори босуръати сенсорро арзёбӣ кунанд, ки дар он қобилияти пайвастшавӣ ба ретсептори GID1 афзоиш ёфт ё аз даст рафт. Ин натиҷаҳо якҷоя тасдиқ мекунанд, ки биосенсори qmRGA вазифаи муштаракро ҳамчун сенсори GA ва GA иҷро мекунад ва нишон медиҳад, ки ифодаи дифференсиалии ретсептори GID1 метавонад эмиссияи сенсорро ба таври назаррас танзим кунад.
То имрӯз, тақсимоти сигналҳои GA дар SAM норавшан боқӣ мемонад. Аз ин рӯ, мо барои ҳисоб кардани харитаҳои миқдории баландсифати фаъолияти сигнализатсияи GA аз растаниҳои qmRGA ва гузоришгари ҳуҷайраҳои бунёдии pCLV3::mCherry-NLS истифода бурдем, ки ба қабати L1 (эпидермис; Расми 4a, b, ба Усулҳо ва Усулҳои иловагӣ нигаред) тамаркуз кард, зеро L1 дар назорати афзоиши SAM нақши калидӣ мебозад36. Дар ин ҷо, ифодаи pCLV3::mCherry-NLS нуқтаи истинодии геометрии собитро барои таҳлили тақсимоти фазоӣ-замонии фаъолияти сигнализатсияи GA фароҳам овард37. Гарчанде ки GA барои рушди узвҳои паҳлӯӣ муҳим ҳисобида мешавад4, мо мушоҳида кардем, ки сигналҳои GA дар примордиуми гулӣ (P) аз марҳилаи P3 сар карда паст буданд (Расми 4a, b), дар ҳоле ки примордиумҳои ҷавони P1 ва P2 фаъолияти мӯътадил доштанд, ки ба минтақаи марказӣ монанд буданд (Расми 4a, b). Фаъолияти баланди сигнализатсияи GA дар сарҳадҳои узви примордиум, ки аз P1/P2 (дар паҳлӯҳои сарҳад) сар шуда, дар P4 ба авҷ мерасад, инчунин дар ҳамаи ҳуҷайраҳои минтақаи периферӣ, ки дар байни примордияҳо ҷойгиранд, муайян карда шуд (Расми 4a, b ва Расми иловагӣ 8a, b). Ин фаъолияти баланди сигнализатсияи GA на танҳо дар эпидермис, балки дар қабатҳои болоии L2 ва L3 низ мушоҳида шуд (Расми иловагӣ 8b). Намунаи сигналҳои GA, ки дар SAM бо истифода аз qmRGA муайян карда шудаанд, низ бо мурури замон бетағйир монд (Расми иловагӣ 8c–f, k). Гарчанде ки сохтори qd17mRGA дар SAM-и растаниҳои T3 аз панҷ хатти мустақил, ки мо онҳоро муфассал тавсиф кардем, ба таври систематикӣ паст карда шуда буд, мо тавонистем намунаҳои флуоресценсияро, ки бо сохтори pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ба даст оварда шудаанд, таҳлил кунем (Расми иловагӣ 8g–j, l). Дар ин хати назоратӣ, танҳо тағйироти ночиз дар таносуби флуоресценсия дар SAM муайян карда шуданд, аммо дар маркази SAM мо коҳиши возеҳ ва ғайричашмдошти VENUS-ро, ки бо TagBFP алоқаманд аст, мушоҳида кардем. Ин тасдиқ мекунад, ки намунаи сигнализатсия, ки аз ҷониби qmRGA мушоҳида мешавад, таназзули вобаста ба GA-и mRGA-VENUS-ро инъикос мекунад, аммо инчунин нишон медиҳад, ки qmRGA метавонад фаъолияти сигнализатсияи GA-ро дар маркази меристем аз ҳад зиёд арзёбӣ кунад. Хулоса, натиҷаҳои мо намунаи сигнализатсияи GA-ро нишон медиҳанд, ки асосан тақсимоти примордияҳоро инъикос мекунад. Ин тақсимоти минтақаи байни ибтидоӣ (IPR) аз сабаби муқаррар шудани тадриҷии фаъолияти баланди сигнализатсияи GA байни примордияи рушдёбанда ва минтақаи марказӣ ба вуҷуд меояд, дар ҳоле ки дар айни замон фаъолияти сигнализатсияи GA дар примордия коҳиш меёбад (Расми 4c, d).
Тақсимоти ретсепторҳои GID1b ва GID1c (нигаред ба боло) нишон медиҳад, ки ифодаи дифференсиалии ретсепторҳои GA ба ташаккули намунаи фаъолияти сигнализатсияи GA дар SAM мусоидат мекунад. Мо фикр кардем, ки оё ҷамъшавии дифференсиалии GA метавонад дар ин ҳолат иштирок кунад. Барои таҳқиқи ин имкон, мо сенсори GA FRET nlsGPS121-ро истифода бурдем. Афзоиши басомади фаъолсозӣ дар SAM-и nlsGPS1, ки бо 10 μM GA4+7 барои 100 дақиқа коркард шудааст, муайян карда шуд (Расми иловагии 9a–e), ки нишон медиҳад, ки nlsGPS1 ба тағирёбии консентратсияи GA дар SAM, чунон ки дар решаҳо21 рух медиҳад, посух медиҳад. Тақсимоти фазоии басомади фаъолсозии nlsGPS1 сатҳи нисбатан пасти GA-ро дар қабатҳои берунии SAM ошкор кард, аммо нишон дод, ки онҳо дар марказ ва дар сарҳадҳои SAM баланд шудаанд (Расми 4e ва Расми иловагии 9a,c). Ин нишон медиҳад, ки GA инчунин дар SAM бо намунаи фазоии қобили муқоиса бо намунаи qmRGA тақсим шудааст. Ҳамчун як равиши мукаммал, мо инчунин SAM-ро бо GA-и флуоресцентӣ (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ё танҳо Fl ҳамчун назорати манфӣ табобат кардем. Сигнали Fl дар тамоми SAM, аз ҷумла минтақаи марказӣ ва примордиум паҳн карда шуд, гарчанде ки бо шиддати пасттар буд (Расми 4j ва Расми иловагӣ 10d). Баръакс, ҳар се GA-Fl махсусан дар дохили сарҳадҳои примордиум ва дар дараҷаҳои гуногун дар боқимондаи IPR ҷамъ шуданд, ки GA7-Fl дар домени калонтарин дар IPR ҷамъ шуд (Расми 4k ва Расми иловагӣ 10a,b). Миқдори шиддати флуоресценсия нишон дод, ки таносуби шиддати IPR ба ғайриIPR дар SAM-и бо GA-Fl коркардшуда дар муқоиса бо SAM-и бо Fl коркардшуда баландтар буд (Расми 4l ва Расми иловагӣ 10c). Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки GA дар консентратсияҳои баландтар дар ҳуҷайраҳои IPR, ки ба сарҳади узв наздиктар ҷойгиранд, мавҷуд аст. Ин нишон медиҳад, ки намунаи фаъолияти сигнализатсияи SAM GA ҳам аз ифодаи дифференсиалии ретсепторҳои GA ва ҳам аз ҷамъшавии дифференсиалии GA дар ҳуҷайраҳои IPR дар наздикии сарҳадҳои узвҳо ба вуҷуд меояд. Ҳамин тариқ, таҳлили мо намунаи ғайричашмдошти фазоӣ-замонии сигнализатсияи GA-ро ошкор кард, ки фаъолияти пасттар дар марказ ва примордиуми SAM ва фаъолияти баландтар дар IPR дар минтақаи периферӣ дорад.
Барои фаҳмидани нақши фаъолияти сигнализатсияи дифференсиалии GA дар SAM, мо бо истифода аз тасвири вақти воқеии SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS, ҳамбастагии байни фаъолияти сигнализатсияи GA, васеъшавии ҳуҷайра ва тақсимоти ҳуҷайраро таҳлил кардем. Бо назардошти нақши GA дар танзими афзоиш, интизор мерафт, ки ҳамбастагии мусбат бо параметрҳои васеъшавии ҳуҷайра вуҷуд дошта бошад. Аз ин рӯ, мо аввал харитаҳои фаъолияти сигнализатсияи GA-ро бо харитаҳои суръати афзоиши сатҳи ҳуҷайра (ҳамчун намояндаи қувваи васеъшавии ҳуҷайра барои ҳуҷайраи додашуда ва барои ҳуҷайраҳои духтар ҳангоми тақсимшавӣ) ва бо харитаҳои анизотропияи афзоиш, ки самти васеъшавии ҳуҷайраро чен мекунад (инчунин дар ин ҷо барои ҳуҷайраи додашуда ва барои ҳуҷайраҳои духтар ҳангоми тақсимшавӣ истифода мешавад; Расми 5a,b, ба Усулҳо ва Усулҳои иловагӣ нигаред). Харитаҳои мо аз суръати афзоиши сатҳи ҳуҷайраҳои SAM бо мушоҳидаҳои қаблӣ38,39 мувофиқанд, ки суръати ҳадди ақали афзоиш дар марз ва суръати максималии афзоиш дар гулҳои рушдёбанда мебошанд (Расми 5a). Таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) нишон дод, ки фаъолияти сигнализатсияи GA бо шиддати афзоиши сатҳи ҳуҷайра робитаи манфӣ дорад (Расми 5c). Мо инчунин нишон додем, ки меҳварҳои асосии тағирёбӣ, аз ҷумла вуруди сигнализатсияи GA ва шиддати афзоиш, нисбат ба самте, ки бо ифодаи баланди CLV3 муайян карда шудааст, ортогоналӣ буданд, ки хориҷ кардани ҳуҷайраҳоро аз маркази SAM дар таҳлилҳои боқимонда тасдиқ кард. Таҳлили коррелятсияи Спирман натиҷаҳои PCA-ро тасдиқ кард (Расми 5d), ки нишон медиҳад, ки сигналҳои GA-и баландтар дар IPR боиси васеъшавии баланди ҳуҷайра нашудаанд. Бо вуҷуди ин, таҳлили коррелятсия коррелятсияи ночизи мусбатро байни фаъолияти сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоиш нишон дод (Расми 5c, d), ки нишон медиҳад, ки сигнализатсияи GA-и баландтар дар IPR ба самти афзоиши ҳуҷайра ва эҳтимолан мавқеи сатҳи тақсимоти ҳуҷайра таъсир мерасонад.
a, b Харитаҳои гармии афзоиши миёнаи сатҳ (a) ва анизотропияи афзоиш (b) дар SAM ба ҳисоби миёна дар ҳафт растании мустақил гирифта шудаанд (мутаносибан ҳамчун проксиҳо барои қувват ва самти васеъшавии ҳуҷайра истифода мешаванд). c Таҳлили PCA тағирёбандаҳои зеринро дар бар мегирифт: сигнали GA, шиддати афзоиши сатҳ, анизотропияи афзоиши сатҳ ва ифодаи CLV3. Ҷузъи PCA 1 асосан бо шиддати афзоиши сатҳ ва бо сигнали GA коррелятсияи манфӣ дошт. Ҷузъи PCA 2 асосан бо анизотропияи афзоиши сатҳ ва бо ифодаи CLV3 коррелятсияи манфӣ дошт. Фоизҳо тағирёбии шарҳдодашударо аз ҷониби ҳар як ҷузъ ифода мекунанд. d Таҳлили коррелятсияи Спирман байни сигнали GA, шиддати афзоиши сатҳ ва анизотропияи афзоиши сатҳ дар миқёси бофта ба истиснои CZ. Рақами тарафи рост арзиши rho Spearman байни ду тағирёбанда аст. Ситорачаҳо ҳолатҳоеро нишон медиҳанд, ки коррелятсия/манфӣ хеле муҳим аст. e Тасвири сеченакаи ҳуҷайраҳои Col-0 SAM L1 тавассути микроскопияи конфокалӣ. Деворҳои нави ҳуҷайра, ки дар SAM (вале на примордиум) дар 10 соат ба вуҷуд омадаанд, мувофиқи арзишҳои кунҷи худ ранг карда мешаванд. Сатри ранг дар кунҷи рости поён нишон дода шудааст. Дар расм тасвири сеченакаи мувофиқ дар 0 соат нишон дода шудааст. Таҷриба ду маротиба бо натиҷаҳои монанд такрор карда шуд. f Графикҳои қуттӣ суръати тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар IPR ва ғайриIPR Col-0 SAM (n = 10 растаниҳои мустақил) нишон медиҳанд. Хатти марказӣ медианаро нишон медиҳад ва сарҳадҳои қуттӣ 25 ва 75-ум процентилҳоро нишон медиҳанд. Мӯйлабҳо арзишҳои ҳадди ақал ва ҳадди аксарро, ки бо нармафзори R муайян карда шудаанд, нишон медиҳанд. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши t-и дуқутбаи Велч ба даст оварда шуданд. g, h Диаграммаи схемавӣ нишон медиҳад, ки (g) чӣ гуна кунҷи девори нави ҳуҷайраро (арғувонӣ) нисбат ба самти радиалӣ аз маркази SAM (хати нуқтадори сафед) чен кардан мумкин аст (танҳо арзишҳои кунҷи тез, яъне 0–90°, ба назар гирифта мешаванд) ва (h) самтҳои даврӣ/паҳлӯӣ ва радиалӣ дар дохили меристем. i Гистограммаҳои басомади самти ҳамвори тақсимоти ҳуҷайра дар саросари SAM (кабуди тира), IPR (кабуди миёна) ва ғайриIPR (кабуди равшан) мутаносибан. Арзишҳои P бо истифода аз озмоиши дуҷонибаи Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. Таҷриба ду маротиба бо натиҷаҳои монанд такрор карда шуд. j Гистограммаҳои басомади самти ҳамвори тақсимоти ҳуҷайра дар атрофи P3 (сабзи равшан), P4 (сабзи миёна) ва P5 (сабзи тира) мутаносибан. Арзишҳои P бо истифода аз озмоиши дуҷонибаи Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. Таҷриба ду маротиба бо натиҷаҳои монанд такрор карда шуд.
Аз ин рӯ, мо минбаъд бо муайян кардани деворҳои ҳуҷайраҳои навтаъсисшуда ҳангоми санҷиш (Расми 5e) ҳамбастагии байни сигнализатсияи GA ва фаъолияти тақсимоти ҳуҷайраро таҳқиқ кардем. Ин равиш ба мо имкон дод, ки басомад ва самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро чен кунем. Бо тааҷҷуб, мо муайян кардем, ки басомади тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR ва боқимондаи SAM (ғайри IPR, Расми 5f) монанд аст, ки нишон медиҳад, ки фарқиятҳо дар сигнализатсияи GA байни ҳуҷайраҳои IPR ва ғайриIPR ба тақсимоти ҳуҷайра таъсири назаррас намерасонанд. Ин ва ҳамбастагии мусбат байни сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоиш моро водор кард, ки фикр кунем, ки оё фаъолияти сигнализатсияи GA метавонад ба самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайра таъсир расонад. Мо самти девори нави ҳуҷайраро ҳамчун кунҷи тез нисбат ба меҳвари радиалӣ, ки маркази меристемаро ва маркази девори нави ҳуҷайраро мепайвандад, чен кардем (Расми 5e-i) ва майли возеҳи тақсимшавии ҳуҷайраҳоро дар кунҷҳои наздик ба 90° нисбат ба меҳвари радиалӣ мушоҳида кардем, ки басомадҳои баландтарин дар 70-80° (23.28%) ва 80-90° (22.62%) мушоҳида шудаанд (Расми 5e,i), ки ба тақсимшавии ҳуҷайраҳо дар самти доиравӣ/бурида мувофиқат мекунанд (Расми 5h). Барои омӯхтани саҳми сигнализатсияи GA ба ин рафтори тақсимшавии ҳуҷайра, мо параметрҳои тақсимшавии ҳуҷайраҳоро дар IPR ва ғайриIPR алоҳида таҳлил кардем (Расми 5i). Мо мушоҳида кардем, ки тақсимоти кунҷи тақсимшавӣ дар ҳуҷайраҳои IPR аз он дар ҳуҷайраҳои ғайриIPR ё дар ҳуҷайраҳо дар тамоми SAM фарқ мекунад, ки ҳуҷайраҳои IPR нисбат ба тақсимоти паҳлӯӣ/даврии ҳуҷайраҳо, яъне 70-80° ва 80-90° (мутаносибан 33.86% ва 30.71%), нишон медиҳанд (Расми 5i). Ҳамин тариқ, мушоҳидаҳои мо робитаи байни сигнализатсияи баланди GA ва самти сатҳи тақсимшавии ҳуҷайраро, ки ба самти даврӣ наздик аст, нишон доданд, ки ба ҳамбастагии байни фаъолияти сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоиш монанд аст (Расми 5c, d). Барои муайян кардани минбаъдаи ҳифзи фазоии ин робита, мо самти сатҳи тақсимшавиро дар ҳуҷайраҳои IPR, ки дар атрофи примордиум ҷойгиранд, аз P3 сар карда чен кардем, зеро баландтарин фаъолияти сигнализатсияи GA дар ин минтақа аз P4 сар карда ошкор карда шуд (Расми 4). Кунҷҳои тақсимшавии IPR дар атрофи P3 ва P4 фарқиятҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳимро нишон надоданд, гарчанде ки дар IPR дар атрофи P4 басомади афзоиши тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳо мушоҳида шуд (Расми 5j). Аммо, дар ҳуҷайраҳои IPR дар атрофи P5, фарқияти самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайра аз ҷиҳати оморӣ аҳамияти калон пайдо кард ва басомади тақсимоти кундаланги ҳуҷайраҳо якбора афзоиш ёфт (Расми 5j). Дар маҷмӯъ, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки сигнализатсияи GA метавонад самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар SAM назорат кунад, ки бо гузоришҳои қаблӣ40,41 мувофиқ аст, ки сигнализатсияи баланди GA метавонад самти паҳлӯии тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар IPR ба вуҷуд орад.
Пешгӯӣ мешавад, ки ҳуҷайраҳо дар IPR на ба примордия, балки ба гиреҳҳои байниҳамдигарӣ дохил карда мешаванд2,42,43. Самти кундаланги тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR метавонад боиси ташкили маъмулии қаторҳои дарозии параллелии ҳуҷайраҳои эпидермалӣ дар гиреҳҳои байниҳамдигарӣ гардад. Мушоҳидаҳои мо, ки дар боло тавсиф шудаанд, нишон медиҳанд, ки эҳтимолан сигнализатсияи GA бо танзими самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар ин раванд нақш мебозад.
Аз даст додани функсияи якчанд генҳои DELLA боиси вокуниши конститутивии GA мегардад ва мутантҳои делла метавонанд барои санҷиши ин фарзия истифода шаванд44. Мо аввал намунаҳои ифодаи панҷ гени DELLA-ро дар SAM таҳлил кардем. Омезиши транскрипсионии хати GUS45 нишон дод, ки GAI, RGA, RGL1 ва RGL2 (ба андозаи хеле камтар) дар SAM ифода ёфтаанд (Расми иловагии 11a–d). Гибридизатсияи in situ минбаъд нишон дод, ки mRNA-и GAI махсусан дар primordia ва гулҳои рушдёбанда ҷамъ мешавад (Расми иловагии 11e). mRNA-и RGL1 ва RGL3 дар тамоми соябони SAM ва дар гулҳои кӯҳнатар ошкор карда шуданд, дар ҳоле ки mRNA-и RGL2 дар минтақаи сарҳадӣ фаровонтар буд (Расми иловагии 11f–h). Тасвири конфокалии pRGL3::RGL3-GFP SAM ифодаеро, ки тавассути гибридизатсияи in situ мушоҳида шудааст, тасдиқ кард ва нишон дод, ки сафедаи RGL3 дар қисми марказии SAM ҷамъ мешавад (Расми иловагии 11i). Бо истифода аз хати pRGA::GFP-RGA, мо инчунин муайян кардем, ки сафедаи RGA дар SAM ҷамъ мешавад, аммо миқдори он дар марз аз P4 сар карда кам мешавад (Расми иловагӣ 11j). Қобили зикр аст, ки намунаҳои ифодаи RGL3 ва RGA бо фаъолияти баландтари сигнализатсияи GA дар IPR мувофиқанд, ки аз ҷониби qmRGA муайян карда шудааст (Расми 4). Ғайр аз ин, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ҳамаи DELLA-ҳо дар SAM ифода ёфтаанд ва ифодаи онҳо дар маҷмӯъ тамоми SAM-ро фаро мегирад.
Мо баъдан параметрҳои тақсимоти ҳуҷайраро дар мутантҳои SAM-и навъи ваҳшӣ (Ler, назорат) ва мутантҳои панҷгонаи (глобалӣ) gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della панҷгонаи (глобалӣ) таҳлил кардем (Расми 6a, b). Ҷолиб он аст, ки мо тағйироти аз ҷиҳати оморӣ назаррасро дар тақсимоти басомадҳои кунҷи тақсимоти ҳуҷайра дар SAM-и мутант-и della global дар муқоиса бо навъи ваҳшӣ мушоҳида кардем (Расми 6c). Ин тағирот дар мутанти della global аз сабаби афзоиши басомади кунҷҳои 80-90° (34.71% нисбат ба 24.55%) ва то андозаи камтар, кунҷҳои 70-80° (23.78% нисбат ба 20.18%) ба амал омадааст, яъне ба тақсимоти ҳуҷайраҳои кундаланг мувофиқат мекунад (Расми 6c). Басомади тақсимоти ғайрикундаланг (0-60°) низ дар мутанти della global камтар буд (Расми 6c). Басомади тақсимоти ҳуҷайраҳои кундаланг дар SAM-и мутант-и глобалии della ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расми 6b). Басомади тақсимоти ҳуҷайраҳои кундаланг дар IPR низ дар мутанти глобалии della нисбат ба навъи ваҳшӣ баландтар буд (Расми 6d). Берун аз минтақаи IPR, навъи ваҳшӣ тақсимоти якхелаи кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраро дошт, дар ҳоле ки мутант-и глобалии della тақсимоти тангенсиалиро ба монанди IPR афзалтар медонист (Расми 6e). Мо инчунин самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар SAM-и мутантҳои панҷгонаи ga2 оксидаза (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ва ga2ox6-2), ки заминаи мутант-ғайрифаъоли GA мебошад, ки дар он GA ҷамъ мешавад, миқдорӣ муайян кардем. Мутобиқи афзоиши сатҳи GA, SAM-и гулшукуфии мутанти панҷгонаи ga2ox нисбат ба гулшукуфии Col-0 калонтар буд (Расми иловагии 12a, b) ва дар муқоиса бо Col-0, SAM-и панҷгонаи ga2ox тақсимоти фарқкунандаи кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраро нишон дод, ки басомади кунҷ аз 50° то 90° афзоиш ёфт, яъне боз тақсимоти тангенсиалиро афзалтар донист (Расми иловагии 12a–c). Ҳамин тариқ, мо нишон медиҳем, ки фаъолшавии конститутсионии сигнализатсияи GA ва ҷамъшавии GA тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳоро дар IPR ва боқимондаи SAM ба вуҷуд меорад.
a, b Тасвири сеченакаи қабати L1-и Ler (a) ва мутанти глобалии делла (b) SAM бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ. Деворҳои нави ҳуҷайра, ки дар SAM (вале на примордиум) дар тӯли 10 соат ташкил шудаанд, мувофиқи арзишҳои кунҷии онҳо нишон дода ва ранг карда шудаанд. Дар варақаи дохилӣ SAM дар 0 соат нишон дода шудааст. Сатри ранг дар кунҷи рости поёнӣ нишон дода шудааст. Тире дар (b) ба мисоли файлҳои ҳуҷайраҳои мувофиқ дар мутанти глобалии делла ишора мекунад. Таҷриба ду маротиба бо натиҷаҳои монанд такрор карда шуд. муқоисаи тақсимоти басомади самтҳои ҳамвори тақсимоти ҳуҷайра дар тамоми SAM (d), IPR (e) ва ғайриIPR (f) байни Ler ва глобалии делла. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши дуҷонибаи Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. f, g Тасвири сеченакаи тасвирҳои конфокалии SAM бо PI ранг кардашудаи растаниҳои трансгении Col-0 (i) ва pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панелҳои (a, b) деворҳои нави ҳуҷайра (вале на примордияҳо)-ро нишон медиҳанд, ки дар давоми 10 соат дар SAM ташаккул ёфтаанд. Таҷриба ду маротиба бо натиҷаҳои монанд такрор карда шуд. h–j Муқоисаи тақсимоти басомади самтҳои ҳамвори тақсимоти ҳуҷайра, ки дар тамоми SAM (h), IPR (i) ва ғайриIPR (j) ҷойгиранд, байни растаниҳои Col-0 ва pCUC2::gai-1-VENUS. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши дуҷонибаи Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд.
Мо баъдан таъсири боздоштани сигнализатсияи GA-ро махсусан дар IPR санҷидем. Барои ин, мо промоутери cotyledon cup 2 (CUC2)-ро барои ба вуҷуд овардани ифодаи сафедаи манфии доминантии gai-1, ки ба VENUS пайваст шудааст (дар хати pCUC2::gai-1-VENUS) истифода бурдем. Дар SAM-и навъи ваҳшӣ, промоутери CUC2 ифодаи аксари IPR-ҳоро дар SAM, аз ҷумла ҳуҷайраҳои сарҳадӣ, аз P4 сар карда ба вуҷуд меорад ва ифодаи мушаххаси монанд дар растаниҳои pCUC2::gai-1-VENUS мушоҳида шуд (нигаред ба зер). Тақсимоти кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайра дар байни SAM ё IPR-и растаниҳои pCUC2::gai-1-VENUS аз навъи ваҳшӣ фарқи назаррас надошт, гарчанде ки ғайричашмдошт мо муайян кардем, ки ҳуҷайраҳои бе IPR дар ин растаниҳо бо басомади баландтари 80-90° тақсим мешаванд (Расми 6f-j).
Пешниҳод шудааст, ки самти тақсимоти ҳуҷайра аз геометрияи SAM, бахусус аз фишори кашиш, ки аз каҷравии бофта ба вуҷуд меояд, вобаста аст46. Аз ин рӯ, мо пурсидем, ки оё шакли SAM дар мутантҳои della global ва растаниҳои pCUC2::gai-1-VENUS тағйир ёфтааст. Тавре ки қаблан гузориш дода шуда буд12, андозаи SAM мутантҳои della global нисбат ба навъи ваҳшӣ калонтар буд (Расми иловагии 13a, b, d). Гибридизатсияи in situ-и CLV3 ва RNA-и STM васеъшавии меристемаро дар мутантҳои della тасдиқ кард ва минбаъд васеъшавии паҳлӯии нишаи ҳуҷайраҳои бунёдиро нишон дод (Расми иловагии 13e, f, h, i). Аммо, каҷравии SAM дар ҳарду генотип монанд буд (Расми иловагии 13k, m, n, p). Мо афзоиши шабеҳи андозаро дар мутанти gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quaruple бидуни тағирёбии каҷӣ дар муқоиса бо намуди ваҳшӣ мушоҳида кардем (Расми иловагӣ 13c, d, g, j, l, o, p). Басомади самти тақсимоти ҳуҷайра низ дар мутанти della quaruple таъсир дошт, аммо нисбат ба мутанти della monolith камтар (Расми иловагӣ 12d-f). Ин таъсири миқдор, дар баробари набудани таъсир ба каҷӣ, нишон медиҳад, ки фаъолияти боқимондаи RGL3 дар мутанти quaruple Della тағйирот дар самти тақсимоти ҳуҷайраро, ки аз гум шудани фаъолияти DELLA ба вуҷуд омадааст, маҳдуд мекунад ва тағйирот дар тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳо дар посух ба тағйирот дар фаъолияти сигнализатсияи GA ба ҷои тағйирот дар геометрияи SAM ба амал меоянд. Тавре ки дар боло тавсиф шудааст, промоутери CUC2 ифодаи IPR-ро дар SAM аз P4 сар карда (Расми иловагии 14a, b) ба вуҷуд меорад ва баръакс, pCUC2::gai-1-VENUS SAM андозаи хурдтар, вале каҷравии баландтар дошт (Расми иловагии 14c–h). Ин тағирот дар морфологияи pCUC2::gai-1-VENUS SAM метавонад боиси тақсимоти гуногуни фишорҳои механикӣ дар муқоиса бо намуди ваҳшӣ гардад, ки дар он фишорҳои баланди даврӣ дар масофаи кӯтоҳтар аз маркази SAM оғоз мешаванд47. Интихобан, тағирот дар морфологияи pCUC2::gai-1-VENUS SAM метавонанд аз тағйирот дар хосиятҳои механикии минтақавӣ, ки аз ҷониби ифодаи трансгенҳо ба вуҷуд омадаанд48, ба вуҷуд оянд. Дар ҳарду ҳолат, ин метавонад таъсири тағирот дар сигнализатсияи GA-ро қисман бо афзоиши эҳтимолияти тақсим шудани ҳуҷайраҳо дар самти даврӣ/кӯтоҳ ҷуброн кунад, ки мушоҳидаҳои моро шарҳ медиҳад.
Маълумоти мо дар маҷмӯъ тасдиқ мекунанд, ки сигнализатсияи GA-и баландтар дар самти паҳлуии сатҳи тақсимоти ҳуҷайра дар IPR нақши фаъол дорад. Онҳо инчунин нишон медиҳанд, ки каҷравии меристемӣ инчунин ба самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайра дар IPR таъсир мерасонад.
Самти кундалангии сатҳи тақсимот дар IPR, аз сабаби фаъолияти баланди сигнализатсияи GA, нишон медиҳад, ки GA файли ҳуҷайраҳои радиалиро дар эпидермис дар дохили SAM пешакӣ ташкил мекунад, то сохтори ҳуҷайравиро, ки баъдтар дар байни гиреҳҳои эпидермалӣ пайдо мешавад, муайян кунад. Дар ҳақиқат, чунин файлҳои ҳуҷайра аксар вақт дар тасвирҳои SAM-и мутантҳои della global дида мешуданд (Расми 6b). Ҳамин тариқ, барои омӯзиши минбаъдаи вазифаи инкишофи намунаи фазоии сигнализатсияи GA дар SAM, мо аз тасвири вақтгузар барои таҳлили сохтори фазоии ҳуҷайраҳо дар IPR дар намудҳои ваҳшӣ (Ler ва Col-0), мутантҳои della global ва растаниҳои трансгении pCUC2::gai-1-VENUS истифода кардем.
Мо муайян кардем, ки qmRGA нишон дод, ки фаъолияти сигнализатсияи GA дар IPR аз P1/P2 афзоиш ёфта, дар P4 ба авҷи худ расидааст ва ин намуна бо мурури замон доимӣ боқӣ монд (Расми 4a–f ва Расми иловагӣ 8c–f, k). Барои таҳлили сохтори фазоии ҳуҷайраҳо дар IPR бо афзоиши сигнали GA, мо ҳуҷайраҳои Ler IPR-ро дар боло ва паҳлӯҳои P4 мувофиқи тақдири инкишофи онҳо, ки 34 соат пас аз мушоҳидаи аввал таҳлил карда шудаанд, яъне беш аз ду маротиба пластидӣ, нишонгузорӣ кардем, ки ба мо имкон медиҳад, ки ҳуҷайраҳои IPR-ро ҳангоми рушди примордиум аз P1/P2 то P4 пайгирӣ кунем. Мо се ранги гуногунро истифода бурдем: зард барои он ҳуҷайраҳое, ки ба примордиум дар наздикии P4 муттаҳид карда шудаанд, сабз барои онҳое, ки дар IPR буданд ва арғувонӣ барои онҳое, ки дар ҳарду раванд иштирок доштанд (Расми 7a–c). Дар t0 (0 соат), 1-2 қабати ҳуҷайраҳои IPR дар пеши P4 намоён буданд (Расми 7a). Тавре ки интизор мерафт, вақте ки ин ҳуҷайраҳо тақсим мешуданд, онҳо ин корро асосан тавассути ҳамвории тақсимоти кундаланг анҷом доданд (Расми 7a–c). Натиҷаҳои монанд бо истифода аз Col-0 SAM (бо тамаркуз ба P3, ки канори он ба P4 дар Лер монанд аст) ба даст оварда шуданд, гарчанде ки дар ин генотип пӯшиши дар канори гулӣ ба вуҷуд омада ҳуҷайраҳои IPR-ро зудтар пинҳон кард (Расми 7g–i). Ҳамин тариқ, шакли тақсимоти ҳуҷайраҳои IPR ҳуҷайраҳоро ба қаторҳои радиалӣ, ба монанди гиреҳҳои байнигиреҳӣ, пешакӣ ташкил медиҳад. Ташкили қаторҳои радиалӣ ва ҷойгиршавии ҳуҷайраҳои IPR байни узвҳои пайдарпай нишон медиҳад, ки ин ҳуҷайраҳо пешгузаштагони байнигиреҳӣ мебошанд.
Дар ин ҷо, мо биосенсори сигнализатсияи GA-и нисбатӣ, qmRGA-ро таҳия кардем, ки имкон медиҳад харитасозии миқдории фаъолияти сигнализатсияи GA-ро, ки дар натиҷаи консентратсияҳои якҷояи ретсепторҳои GA ва GA ба вуҷуд меояд, дар айни замон халалдоркуниро ба роҳҳои сигнализатсияи эндогенӣ кам мекунад ва бо ин васила маълумотро дар бораи функсияи GA дар сатҳи ҳуҷайра пешниҳод мекунад. Барои ин, мо як сафедаи тағйирёфтаи DELLA, mRGA-ро сохтем, ки қобилияти пайваст кардани шарикони таъсири DELLA-ро аз даст додааст, аммо ба протеолизи аз ҷониби GA ба вуҷуд омада ҳассос боқӣ мемонад. qmRGA ба тағйироти экзогенӣ ва эндогенӣ дар сатҳҳои GA посух медиҳад ва хосиятҳои ҳассосияти динамикии он имкон медиҳанд, ки тағйироти фазоӣ-замонӣ дар фаъолияти сигнализатсияи GA ҳангоми рушд арзёбӣ карда шаванд. qmRGA инчунин як воситаи хеле чандир аст, зеро онро бо тағир додани промоутери истифодашуда барои ифодаи он (агар лозим бошад) ба бофтаҳои гуногун мутобиқ кардан мумкин аст ва бо назардошти хусусияти ҳифзшудаи роҳи сигнализатсияи GA ва мотиви PFYRE дар байни ангиоспермҳо, эҳтимол дорад, ки он ба дигар намудҳо интиқол дода шавад22. Мутобиқи ин, як мутатсияи эквивалентӣ дар сафедаи DELLA-и биринҷии SLR1 (HYY497AAA) низ нишон дода шуд, ки фаъолияти репрессори афзоиши SLR1-ро пахш мекунад ва дар айни замон танҳо каме коҳиши таназзули он, ки аз ҷониби GA ба вуҷуд омадааст, монанд ба mRGA23, кам мекунад. Қобили зикр аст, ки таҳқиқоти ахир дар Arabidopsis нишон доданд, ки як мутатсияи аминокислота дар домени PFYRE (S474L) фаъолияти транскрипсионии RGA-ро бе таъсир расонидан ба қобилияти он барои ҳамкорӣ бо шарикони омили транскрипсия50 тағйир додааст. Гарчанде ки ин мутатсия ба 3 ивазкунии аминокислота, ки дар mRGA мавҷуданд, хеле наздик аст, таҳқиқоти мо нишон медиҳанд, ки ин ду мутатсия хусусиятҳои фарқкунандаи DELLA-ро тағйир медиҳанд. Гарчанде ки аксари шарикони омили транскрипсия ба доменҳои LHR1 ва SAW-и DELLA26,51 пайваст мешаванд, баъзе аминокислотаҳои ҳифзшуда дар домени PFYRE метавонанд ба устувор кардани ин таъсири мутақобила мусоидат кунанд.
Рушди байнигиреҳҳо хусусияти калидӣ дар меъмории растанӣ ва беҳтар кардани ҳосилнокӣ мебошад. qmRGA фаъолияти баланди сигнализатсияи GA-ро дар ҳуҷайраҳои пешгузаштаи байнигиреҳҳои IPR ошкор кард. Бо якҷоя кардани тасвири миқдорӣ ва генетика, мо нишон додем, ки намунаҳои сигнализатсияи GA сатҳҳои тақсимоти даврашакл/урдонаи ҳуҷайраҳоро дар эпидермиси SAM якҷоя мекунанд ва ташкили тақсимоти ҳуҷайраро, ки барои рушди байнигиреҳҳо зарур аст, ташаккул медиҳанд. Якчанд танзимгарони самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайраҳо ҳангоми рушд муайян карда шудаанд52,53. Кори мо мисоли равшани он аст, ки чӣ гуна фаъолияти сигнализатсияи GA ин параметри ҳуҷайраро танзим мекунад. DELLA метавонад бо комплексҳои сафедаи пешакӣ ҷамъшаванда41 ҳамкорӣ кунад, аз ин рӯ сигнализатсияи GA метавонад самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайраҳоро тавассути таъсири мустақим ба самти микронайчаҳои кортикалӣ танзим кунад40,41,54,55. Мо ғайричашмдошт нишон додем, ки дар SAM, коррелятсияи фаъолияти баландтари сигнализатсияи GA дарозшавӣ ё тақсимоти ҳуҷайра набуд, балки танҳо анизотропияи афзоиш буд, ки бо таъсири мустақими GA ба самти тақсимоти ҳуҷайра дар IPR мувофиқ аст. Аммо, мо наметавонем истисно кунем, ки ин таъсир инчунин метавонад ғайримустақим бошад, масалан, тавассути нарм кардани девори ҳуҷайраҳои аз ҷониби GA ба вуҷуд омада56. Тағйирот дар хосиятҳои девори ҳуҷайра боиси стресси механикӣ мегардад57,58, ки инчунин метавонад ба самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайра тавассути таъсир расонидан ба самти микронайчаҳои кортикалӣ таъсир расонад39,46,59. Таъсири якҷояи стресси механикии аз ҷониби GA ба вуҷуд омада ва танзими мустақими самти микронайчаҳо аз ҷониби GA метавонад дар тавлиди як намунаи мушаххаси самти тақсимоти ҳуҷайра дар IPR барои муайян кардани гиреҳҳои дохилӣ иштирок кунад ва барои санҷидани ин идея таҳқиқоти минбаъда лозим аст. Ба ҳамин монанд, таҳқиқоти қаблӣ аҳамияти сафедаҳои мутақобилаи TCP14 ва 15-ро, ки бо DELLA ҳамкорӣ мекунанд, дар назорати ташаккули гиреҳҳои дохилӣ60,61 таъкид кардаанд ва ин омилҳо метавонанд амали GA-ро якҷоя бо BREVIPEDICELLUS (BP) ва PENNYWISE (PNY), ки рушди гиреҳҳои дохилиро танзим мекунанд ва нишон дода шудааст, ки ба сигнализатсияи GA таъсир мерасонанд2,62, миёнаравӣ кунанд. Бо назардошти он, ки DELLA-ҳо бо роҳҳои сигнализатсияи брассиностероид, этилен, кислотаи жасмонӣ ва кислотаи абсцизӣ (ABA)63,64 ҳамкорӣ мекунанд ва ин гормонҳо метавонанд ба самти микронайчаҳо65 таъсир расонанд, таъсири GA ба самти тақсимоти ҳуҷайра низ метавонад аз ҷониби дигар гормонҳо ба миён ояд.
Тадқиқотҳои аввали ситологӣ нишон доданд, ки ҳам минтақаҳои дарунӣ ва ҳам берунии SAM-и Arabidopsis барои рушди байнигиреҳҳо заруранд2,42. Он далел, ки GA тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар бофтаҳои дарунӣ фаъолона танзим мекунад12, вазифаи дугонаи GA-ро дар танзими андозаи меристема ва байнигиреҳҳо дар SAM дастгирӣ мекунад. Намунаи тақсимоти самтии ҳуҷайраҳо низ дар бофтаи дохилии SAM сахт танзим карда мешавад ва ин танзим барои афзоиши поя муҳим аст52. Ҷолиб хоҳад буд, ки оё GA инчунин дар самти сатҳи тақсимоти ҳуҷайра дар созмони дохилии SAM нақш мебозад ва бо ин васила мушаххасот ва рушди байнигиреҳҳоро дар дохили SAM ҳамоҳанг мекунад.
Растаниҳо дар шароити in vitro дар хок ё 1 муҳити Мурашиге-Скуг (MS) (Duchefa), ки бо 1% сахароза ва 1% агар (Sigma) илова карда шудааст, дар шароити стандартӣ (16 соат рӯшноӣ, 22 °C) парвариш карда шуданд, ба истиснои таҷрибаҳои гипокотил ва афзоиши реша, ки дар онҳо ниҳолҳо дар табақҳои амудӣ дар зери рӯшноии доимӣ ва 22 °C парвариш карда шуданд. Барои таҷрибаҳои нитратӣ, растаниҳо дар муҳити тағйирёфтаи MS (муҳити растании bioWORLD), ки бо нитрати кофӣ (0 ё 10 мМ KNO3), 0.5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза ва 1% A-агар (Sigma) илова карда шудааст, дар шароити рӯзи дароз парвариш карда шуданд.
КДНК-и GID1a, ки ба pDONR221 ворид карда шуд, бо pDONR P4-P1R-pUBQ10 ва pDONR P2R-P3-mCherry ба pB7m34GW барои тавлиди pUBQ10::GID1a-mCherry рекомбинасия карда шуд. ДНК-и IDD2, ки ба pDONR221 ворид карда шуд, барои тавлиди p35S:IDD2-RFP ба pB7RWG266 рекомбинасия карда шуд. Барои тавлиди pGID1b::2xmTQ2-GID1b, порчаи 3.9 кб дар болооби минтақаи рамзгузории GID1b ва порчаи 4.7 кб, ки дорои кДНК-и GID1b (1.3 кб) ва терминатор (3.4 кб) буд, аввал бо истифода аз праймерҳои дар Ҷадвали Иловагии 3 овардашуда амплификация карда шуданд ва сипас мутаносибан ба pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ва pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ворид карда шуданд ва дар ниҳоят бо pDONR221 2xmTQ268 ба вектори мақсадноки pGreen 012567 бо истифода аз клонкунии Gateway аз нав муттаҳид карда шуданд. Барои тавлиди pCUC2::LSSmOrange, пайдарпайии промоутери CUC2 (3229 bp дар боло аз ATG) ва баъдан пайдарпайии рамзгузории mOrange-и калони Стокс-гузаранда (LSSmOrange)69 бо сигнали маҳаллисозии ҳастаии N7 ва терминатори транскрипсияи NOS бо истифода аз системаи рекомбинатсияи порчаи Gateway 3 (Invitrogen) ба вектори ҳадафгирии канамицини pGreen ҷамъ карда шуданд. Вектори дуии растанӣ ба штамми Agrobacterium tumefaciens GV3101 ворид карда шуд ва мутаносибан бо усули инфилтратсияи Agrobacterium ба баргҳои Nicotiana benthamiana ва бо усули тар кардани гул ба Arabidopsis thaliana Col-0 ворид карда шуд. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ва pCLV3::mCherry-NLS qmRGA мутаносибан аз наслҳои F3 ва F1-и салибҳои мувофиқ ҷудо карда шуданд.
Гибридизатсияи RNA дар ҷой дар нӯгҳои навдаҳои тақрибан 1 см72 анҷом дода шуд, ки ҷамъоварӣ ва фавран дар маҳлули FAA (3.7% формальдегид, 5% кислотаи сирко, 50% этанол), ки пешакӣ то 4 °C хунук карда шуда буд, фиксатсия карда шуданд. Пас аз коркарди вакуумии 2 × 15 дақиқа, фиксатор иваз карда шуд ва намунаҳо шабона инкубатсия карда шуданд. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ва RGL3 cDNA ва зондҳои антисенсӣ ба 3′-UTR-ҳои онҳо бо истифода аз праймерҳое, ки дар Ҷадвали Иловагии 3 нишон дода шудаанд, тавре ки аз ҷониби Розьер ва дигарон73 тавсиф шудаанд, синтез карда шуданд. Зондҳои бо дигоксигенин нишонгузорӣшуда бо истифода аз антителоҳои дигоксигенин (3000 маротиба обшуда; Roche, рақами каталог: 11 093 274 910) иммунодетектив карда шуданд ва қисмҳо бо маҳлули 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP, 250 маротиба обшуда)/тетразоли нитроблу (NBT, 200 маротиба обшуда) ранг карда шуданд.
Вақти нашр: 10 феврали соли 2025