Афзоиши меристемаи апикалӣ (SAM) барои меъмории поя муҳим аст. Гормонҳои растанӣгиббереллинҳо(GAs) дар ҳамоҳангсозии афзоиши растанӣ нақшҳои калидӣ мебозанд, аммо нақши онҳо дар САМ ҳанӯз ба таври кофӣ фаҳмида нашудааст. Дар ин ҷо, мо биосенсори рационалиметрии сигнализатсияи GA тавассути муҳандисии протеини DELLA таҳия кардем, то функсияи муҳими танзимкунандаи он дар аксуламали транскрипсияи GA ва нигоҳ доштани таназзули он ҳангоми шинохти GA нигоҳ дошта шавад. Мо нишон медиҳем, ки ин биосенсори ба таназзул асосёфта тағиротро дар сатҳи GA ва ҳассосияти ҳуҷайра ҳангоми рушд ба таври дақиқ сабт мекунад. Мо ин биосенсорро барои харитаи фаъолияти сигнализатсияи GA дар SAM истифода бурдем. Мо нишон медиҳем, ки сигналҳои баланди GA асосан дар ҳуҷайраҳои байни примордияҳои узв ҷойгиранд, ки пешгузаштаи ҳуҷайраҳои байни гиреҳҳо мебошанд. Бо истифода аз равишҳои фоида ва аз даст додани функсия, мо минбаъд нишон медиҳем, ки GA самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро танзим карда, ташкили каноникии ҳуҷайраҳои байнинодҳоро муқаррар мекунад ва ба ин васила мушаххасоти байни гиреҳҳоро дар SAM мусоидат мекунад.
Меристемаи апикалии навда (SAM), ки дар қуллаи навда ҷойгир аст, дорои чароғаки ҳуҷайраҳои бунёдӣ мебошад, ки фаъолияти онҳо узвҳои паҳлуӣ ва гиреҳҳои пояро дар тӯли тамоми ҳаёти растанӣ ба таври модулӣ ва такрорӣ тавлид мекунад. Ҳар яке аз ин воҳидҳои такрорӣ ё гиреҳҳои растанӣ дар гиреҳҳо ва узвҳои паҳлӯӣ ва меристемаҳои аксиллярӣ дар тирҳои баргҳо дохил мешаванд1. Нашъунамо ва ташкили гиреҳҳои растанӣ ҳангоми рушд тағйир меёбад. Дар арабидопсис нашъунамои байни гиреҳҳо дар давраи вегетативӣ қатъ карда мешавад ва меристемаҳои аксилярӣ дар колои баргҳои розетка хобидаанд. Дар давраи гузариш ба давраи гулдор САМ ба меристемаи гулбарг мубаддал шуда, байни гиреххои дароз ва навдаи тахта, шохачахо дар колои баргхои каулин ва баъдтар гулхои бебарг пайдо мешаванд2. Гарчанде ки мо дар фаҳмидани механизмҳое, ки ба пайдоиши баргҳо, гулҳо ва шохаҳо назорат мекунанд, пешрафти назаррас ба даст овардаем, аммо дар бораи чӣ гуна пайдоиши байни узвҳо каме маълум аст.
Фаҳмидани тақсимоти фазо-вақтии GA барои беҳтар фаҳмидани вазифаҳои ин гормонҳо дар бофтаҳои гуногун ва дар марҳилаҳои гуногуни рушд кӯмак мекунад. Визуалии таназзули синтези RGA-GFP, ки дар зери амали промоутери худ ифода ёфтааст, маълумоти муҳимро дар бораи танзими сатҳи умумии GA дар решаҳо медиҳад15,16. Аммо, ифодаи RGA дар тамоми бофтаҳо фарқ мекунад17 ва аз ҷониби GA18 танзим карда мешавад. Ҳамин тариқ, ифодаи дифференсиалии промоутери RGA метавонад ба намунаи флуоресценти бо RGA-GFP мушоҳидашуда оварда расонад ва аз ин рӯ, ин усул миқдорӣ нест. Ба наздикӣ, флуоресцеини биоактивӣ (Fl) бо нишони GA19,20 ҷамъшавии GA-ро дар эндокортекси реша ва танзими сатҳи ҳуҷайравии онро тавассути интиқоли GA ошкор кард. Ба наздикӣ, сенсори GA FRET nlsGPS1 нишон дод, ки сатҳи GA бо дарозшавии ҳуҷайраҳо дар решаҳо, филаментҳо ва гипокотилҳои торик парваришшуда алоқаманд аст21. Аммо, тавре ки мо дидем, консентратсияи GA ягона параметрест, ки фаъолияти сигнализатсияи GA-ро назорат мекунад, зеро он аз равандҳои мураккаби ҳассос вобаста аст. Дар ин ҷо, дар асоси фаҳмиши мо дар бораи роҳҳои сигнализатсияи DELLA ва GA, мо дар бораи таҳия ва тавсифи биосенсори таназзули ратсиметрӣ барои сигнализатсияи GA гузориш медиҳем. Барои таҳияи ин биосенсори миқдорӣ, мо як RGA-и мутантии ҳассоси GA-ро истифода бурдем, ки бо протеини флуоресцентӣ муттаҳид шуда, дар ҳама ҷо дар бофтаҳо ифода ёфтааст, инчунин протеини флуоресценти GA-ҳассос. Мо нишон медиҳем, ки омезиши протеинҳои мутант RGA ба сигнализатсияи эндогении GA халал намерасонад ва ин биосенсор метавонад фаъолияти сигнализатсияро, ки дар натиҷаи ҳам вуруди GA ва ҳам коркарди сигнали GA аз ҷониби дастгоҳи ҳассос бо ҳалли баланди фазо-вақтӣ ба вуҷуд омадааст, муайян кунад. Мо ин биосенсорро барои харитаи тақсимоти фазо-вақтии фаъолияти сигнализатсияи GA истифода бурдем ва муайян кунем, ки чӣ тавр GA рафтори ҳуҷайраро дар эпидермиси SAM танзим мекунад. Мо нишон медиҳем, ки GA самти тақсимоти ҳуҷайраҳои SAM-ро, ки дар байни примордияҳои узв ҷойгир аст, танзим мекунад ва ба ин васила ташкилоти каноникии ҳуҷайравии интернодро муайян мекунад.
Дар ниҳоят, мо пурсидем, ки оё qmRGA метавонад дар бораи тағирот дар сатҳи эндогении GA бо истифода аз гипокотилҳои афзоиш гузориш диҳад. Мо қаблан нишон дода будем, ки нитрат афзоишро тавассути афзоиши синтези GA ва дар навбати худ таназзули DELLA34 ҳавасманд мекунад. Мутаносибан, мо мушоҳида кардем, ки дарозии гипокотил дар ниҳолҳои pUBQ10::qmRGA, ки дар зери захираи фаровони нитрат (10 mM NO3−) парвариш карда шудаанд, нисбат ба ниҳолҳои дар шароити норасоии нитрат парваришшуда ба таври назаррас дарозтар буд (расми 6а). Мувофиқи аксуламали афзоиш, сигналҳои GA дар гипокотилҳои ниҳолҳои дар шароити 10 mM NO3− парваришшуда нисбат ба ниҳолҳои дар набудани нитрат парваришшуда баландтар буданд (Расми 6b, в). Ҳамин тариқ, qmRGA инчунин имкон медиҳад, ки тағирот дар сигнализатсияи GA, ки бо тағирёбии эндогенӣ дар консентратсияи GA ба вуҷуд омадаанд.
Барои фаҳмидани он, ки оё фаъолияти сигнализатсияи GA, ки аз ҷониби qmRGA муайян карда шудааст, аз консентратсияи GA ва дарки GA вобаста аст, тавре ки дар асоси тарҳи сенсор интизор аст, мо ифодаи се ретсепторҳои GID1-ро дар бофтаҳои растанӣ ва репродуктивӣ таҳлил кардем. Дар ниҳолҳо, хатти хабарнигори GID1-GUS нишон дод, ки GID1a ва c дар cotyledons баланд ифода карда шудаанд (расми 3a-c). Илова бар ин, ҳар се ретсепторҳо дар баргҳо, решаи паҳлӯӣ, нӯги реша (ба истиснои сарпӯши решаи GID1b) ва системаи рагҳо ифода карда шуданд (расми 3a–c). Дар SAM inflorescence, мо сигналҳои GUS-ро танҳо барои GID1b ва 1c ошкор кардем (Расми иловагӣ 7a–c). Гибридизатсияи in situ ин намунаҳои ифодаро тасдиқ кард ва минбаъд нишон дод, ки GID1c дар сатҳҳои паст дар SAM яксон ифода шудааст, дар ҳоле ки GID1b дар канори SAM ифодаи баландтар нишон дод (Расми иловагӣ 7d-l). Омехтаи тарҷумаи pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b инчунин як қатор дараҷаи ифодаи GID1b -ро аз ифодаи паст ё тамоман дар маркази SAM то ифодаи баланд дар сарҳадҳои узв ошкор кард (расми иловагӣ 7m). Ҳамин тариқ, ретсепторҳои GID1 дар байни ва дар дохили бофтаҳо яксон тақсим карда намешаванд. Дар таҷрибаҳои минбаъда, мо инчунин мушоҳида кардем, ки аз ҳад зиёди GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) ҳассосияти qmRGA-ро дар гипокотилҳо ба барномаи берунии GA зиёд кардааст (расми 3d, д). Баръакси ин, флуорессенсия, ки аз ҷониби qd17mRGA дар гипокотил чен карда шудааст, ба табобати GA3 ҳассос набуд (расми 3f, g). Барои ҳарду таҳлил, ниҳолҳо бо консентратсияи баланди GA (100 μM GA3) коркард карда шуданд, то рафтори босуръати сенсорро арзёбӣ кунанд, ки дар он қобилияти пайвастшавӣ ба ретсептори GID1 афзоиш ёфтааст ё гум шудааст. Якҷоя, ин натиҷаҳо тасдиқ мекунанд, ки биосенсори qmRGA вазифаи якҷояро ҳамчун сенсори GA ва GA иҷро мекунад ва нишон медиҳад, ки ифодаи дифференсиалии ретсептори GID1 метавонад қобилияти эмиссияи сенсорро ба таври назаррас тағйир диҳад.
То имрӯз, тақсимоти сигналҳои GA дар SAM норавшан боқӣ мемонад. Аз ин рӯ, мо растаниҳои ифодакунандаи qmRGA ва pCLV3::mCherry-NLS Reporter35 ҳуҷайраҳои бунёдиро барои ҳисоб кардани харитаҳои миқдории баландсифати фаъолияти сигнализатсияи GA, ки тамаркуз ба қабати L1 (эпидерма; Расми 4a, b, нигаред ба Усулҳо ва усулҳои иловагӣ) истифода бурдем, зеро нақши калидӣ дар назорати афзоиши L16. Дар ин ҷо, ифодаи pCLV3 :: mCherry-NLS як нуқтаи геометрии собитро барои таҳлили тақсимоти фазо-вақтии фаъолияти сигнализатсияи GA таъмин намуд37. Гарчанде ки GA барои рушди узвҳои паҳлуӣ муҳим ҳисобида мешавад4, мо мушоҳида кардем, ки сигналҳои GA дар примордиуми гулдор (P) аз марҳилаи P3 (расми 4а, б) кам буданд, дар ҳоле ки примордиумҳои ҷавони P1 ва P2 фаъолияти мӯътадили шабеҳ дар минтақаи марказӣ доштанд (расми 4а, б). Фаъолияти баланди сигнализатсияи GA дар сарҳадҳои ибтидоии узвҳо, аз P1/P2 (дар паҳлӯҳои сарҳад) оғоз ёфта, дар P4 ба авҷи аъло мерасад, инчунин дар ҳама ҳуҷайраҳои минтақаи периферӣ, ки дар байни примордия ҷойгиранд (расми 4a, b ва Расми 8а, б). Ин фаъолияти баландтари сигнализатсияи GA на танҳо дар эпидермис, балки дар қабатҳои L2 ва болоии L3 низ мушоҳида карда шуд (расми 8б). Намунаи сигналҳои GA, ки дар SAM бо истифода аз qmRGA ошкор шудааст, низ бо мурури замон бетағйир монд (Расми иловагӣ 8c-f, k). Гарчанде ки сохтори qd17mRGA дар SAM растаниҳои T3 аз панҷ хати мустақил, ки мо ба таври муфассал тавсиф карда будем, ба таври мунтазам коҳиш дода шуда буд, мо тавонистем намунаҳои флуоресцентиро, ки бо сохти pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP гирифта шудаанд, таҳлил кунем (Расми иловагӣ 8g-j, l). Дар ин хати назорат, дар SAM танҳо тағироти ночиз дар таносуби флуоресцентсия ошкор карда шуд, аммо дар маркази SAM мо коҳиши равшан ва ғайричашмдошти VENUS-ро, ки бо TagBFP алоқаманд аст, мушоҳида кардем. Ин тасдиқ мекунад, ки шакли сигнализатсия, ки аз ҷониби qmRGA мушоҳида мешавад, таназзули аз GA вобастаи mRGA-VENUS-ро инъикос мекунад, аммо инчунин нишон медиҳад, ки qmRGA метавонад фаъолияти сигнализатсияи GA-ро дар маркази меристема аз ҳад зиёд арзёбӣ кунад. Хулоса, натиҷаҳои мо шакли сигнали GA-ро ошкор мекунанд, ки пеш аз ҳама тақсимоти примордияро инъикос мекунанд. Ин таќсимоти минтаќаи байнипавлодї (ИПР) аз њисоби тадриљан ба роњ мондани фаъолияти баланди сигнализатсия дар байни примордиуми инкишофёбанда ва минтаќаи марказї вобаста аст, дар айни замон фаъолияти сигнализатсияи ГА дар примордиум кам мешавад (расми 4в, г).
Тақсимоти ретсепторҳои GID1b ва GID1c (нигаред ба боло) аз он шаҳодат медиҳад, ки ифодаи дифференсиалии ретсепторҳои GA ба ташаккули шакли фаъолияти сигнализатсияи GA дар SAM мусоидат мекунад. Мо дар ҳайрат будем, ки оё ҷамъшавии дифференсиалии GA метавонад ҷалб карда шавад. Барои таҳқиқи ин имкон, мо сенсори nlsGPS1 GA FRET21-ро истифода бурдем. Дар SAM-и nlsGPS1, ки бо 10 μM GA4+7 дар тӯли 100 дақиқа коркард шудааст, басомади афзояндаи фаъолсозӣ ошкор карда шуд (Расми иловагӣ 9a–e), ки нишон медиҳад, ки nlsGPS1 ба тағирёбии консентратсияи GA дар SAM, тавре ки дар решаҳо вокуниш нишон медиҳад21. Тақсимоти фазоии басомади фаъолсозии nlsGPS1 сатҳи нисбатан пасти GA-ро дар қабатҳои берунии SAM ошкор кард, аммо нишон дод, ки онҳо дар марказ ва сарҳадҳои SAM баланд шудаанд (расми 4e ва расми иловагӣ 9a,c). Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки GA инчунин дар SAM бо намунаи фазоии муқоисашаванда бо он ки qmRGA ошкор кардааст, тақсим карда мешавад. Ҳамчун равиши иловагӣ, мо инчунин SAM-ро бо флуоресценти GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ё танҳо Fl ҳамчун назорати манфӣ баррасӣ кардем. Сигнал Fl дар саросари SAM, аз ҷумла дар минтақаи марказӣ ва примордиум, ҳарчанд бо шиддати камтар паҳн карда шуд (расми 4j ва расми иловагӣ 10d). Баръакси ин, ҳар се GA-Fl махсусан дар ҳудуди ибтидоӣ ва ба дараҷаҳои гуногун дар қисми боқимондаи IPR ҷамъ шудаанд ва GA7-Fl дар бузургтарин домени IPR ҷамъ мешаванд (расми 4k ва расми иловагӣ 10a, b). Миқдори шиддатнокии флуорессенсия нишон дод, ки таносуби шиддатнокии IPR ба ғайри IPR дар SAM-и бо GA-Fl коркардшуда нисбат ба SAM бо Fl коркардшуда баландтар буд (расми 4l ва расми иловагӣ 10c). Якҷоя, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки GA дар консентратсияи баландтар дар ҳуҷайраҳои IPR, ки дар наздиктарин сарҳади узв ҷойгиранд, мавҷуд аст. Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки шакли фаъолияти сигнализатсияи SAM GA ҳам аз ифодаи дифференсиалии ретсепторҳои GA ва ҳам ҷамъшавии дифференсиалии GA дар ҳуҷайраҳои IPR дар наздикии сарҳадҳои узвҳо ба вуҷуд меояд. Ҳамин тариқ, таҳлили мо шакли ғайричашмдошти фазо-вақтии сигнализатсияи GA-ро бо фаъолнокии паст дар марказ ва примордиуми SAM ва фаъолияти баландтар дар IPR дар минтақаи периферӣ ошкор кард.
Барои фаҳмидани нақши фаъолияти дифференсиалии сигнализатсияи GA дар SAM, мо таносуби байни фаъолияти сигнализатсияи GA, тавсеаи ҳуҷайра ва тақсимоти ҳуҷайраро бо истифода аз тасвири вақти воқеӣ дар SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS таҳлил кардем. Бо назардошти нақши GA дар танзими афзоиш, таносуби мусбӣ бо параметрҳои густариши ҳуҷайра интизор буд. Аз ин рӯ, мо аввал харитаҳои фаъолияти сигнализатсияи GA-ро бо харитаҳои суръати афзоиши сатҳи ҳуҷайра (ҳамчун прокси қобилияти васеъшавии ҳуҷайраҳо барои ҳуҷайраҳои додашуда ва барои ҳуҷайраҳои духтар ҳангоми тақсимшавӣ) ва бо харитаҳои анизотропияи афзоиш, ки самти васеъшавии ҳуҷайраҳоро чен мекунад (инчунин дар ин ҷо барои ҳуҷайраҳои додашуда ва барои ҳуҷайраҳои духтар ҳангоми тақсим истифода мешавад) муқоиса кардем; Усули 5a, Усул ва Усул, нигаред. Харитаҳои мо дар бораи суръати афзоиши сатҳи ҳуҷайраҳои SAM бо мушоҳидаҳои қаблӣ мувофиқат мекунанд38,39, бо суръати ҳадди ақали афзоиш дар сарҳад ва суръати максималии афзоиши гулҳои инкишофёбанда (расми 5а). Таҳлили ҷузъҳои асосӣ (PCA) нишон дод, ки фаъолияти сигнализатсияи GA бо шиддатнокии афзоиши сатҳи ҳуҷайра манфӣ дорад (Расми 5c). Мо инчунин нишон додем, ки меҳварҳои асосии тағирёбанда, аз ҷумла вуруди сигнали GA ва шиддатнокии афзоиш, ба самти бо ифодаи баланди CLV3 муайяншуда ортогоналӣ буданд, ки хориҷ кардани ҳуҷайраҳоро аз маркази SAM дар таҳлилҳои боқимонда тасдиқ мекунанд. Таҳлили коррелятсияи Спирман натиҷаҳои PCA-ро тасдиқ кард (Расми 5d), ки нишон медиҳад, ки сигналҳои баландтари GA дар IPR боиси васеъшавии ҳуҷайраҳои баландтар нашудаанд. Аммо, таҳлили коррелятсия таносуби каме мусбати байни фаъолияти сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоишро ошкор кард (Расми 5c, d), ки нишон медиҳад, ки сигнализатсияи баландтари GA дар IPR ба самти афзоиши ҳуҷайраҳо ва эҳтимолан мавқеи ҳавопаймои тақсимоти ҳуҷайра таъсир мерасонад.
a, b Харитаҳои гармии афзоиши миёнаи сатҳи рӯизаминӣ (a) ва анизотропияи афзоиш (б) дар SAM ба ҳисоби миёна зиёда аз ҳафт растании мустақилро ташкил медиҳанд (мутаносибан ҳамчун прокси барои қувват ва самти густариши ҳуҷайраҳо истифода мешаванд). в Таҳлили PCA тағирёбандаҳои зеринро дар бар гирифт: сигнали GA, шиддатнокии афзоиши сатҳи рӯизаминӣ, анизотропияи афзоиши сатҳ ва ифодаи CLV3. Ҷузъи PCA 1 асосан бо шиддатнокии афзоиши сатҳи манфӣ алоқаманд буд ва бо сигнали GA мусбат алоқаманд буд. Ҷузъи PCA 2 асосан бо анизотропияи афзоиши сатҳи мусбӣ ва бо ифодаи CLV3 манфӣ алоқаманд буд. Фоизҳо тағирёбии ҳар як ҷузъро ифода мекунанд. d Таҳлили коррелятсияи Спирман байни сигнали GA, шиддатнокии афзоиш ва анизотропияи афзоиши сатҳи рӯи миқёси матоъ ба истиснои CZ. Рақам дар тарафи рост арзиши Spearman rho байни ду тағирёбанда аст. Ситораҳо ҳолатҳоеро нишон медиҳанд, ки таносуб/манфӣ хеле муҳим аст. д Визуализатсияи 3D ҳуҷайраҳои Col-0 SAM L1 тавассути микроскопияи конфокалӣ. Деворҳои нави ҳуҷайра, ки дар САМ (вале на дар аввал) дар 10 соат ба вуҷуд омадаанд, мувофиқи арзишҳои кунҷи худ ранг карда мешаванд. Сатри ранг дар кунҷи рости поён нишон дода мешавад. Вуруд тасвири мувофиқи 3D-ро дар 0 соат нишон медиҳад. Тачриба ду маротиба бо натичахои якхела такрор карда шуд. f Қитъаҳои қуттӣ суръати тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар IPR ва ғайри IPR Col-0 SAM (n = 10 растании мустақил) нишон медиҳанд. Хати марказӣ миёнаравро нишон медиҳад ва сарҳадҳои қуттӣ фоизҳои 25 ва 75-ро нишон медиҳанд. Вискҳо арзишҳои ҳадди ақал ва ҳадди аксарро, ки бо нармафзори R муайян шудаанд, нишон медиҳанд. Қиматҳои P бо санҷиши ду думдори Welch ба даст оварда шуданд. g, h Диаграммаи схематикӣ, ки нишон медиҳад (g) чӣ гуна чен кардани кунҷи девори нави ҳуҷайра (магента) нисбат ба самти радиалӣ аз маркази SAM (хати нуқтаи сафед) (танҳо арзишҳои кунҷи шадид, яъне 0–90° ба назар гирифта мешаванд) ва (h) самтҳои даврӣ/паҳлуӣ ва радиалӣ дар дохили меристем. i Гистограммаҳои басомади самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар саросари SAM (кабуди торик), IPR (кабуди миёна) ва ғайри IPR (кабуди равшан). Қиматҳои P тавассути санҷиши ду думдор Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. Тачриба ду маротиба бо натичахои якхела такрор карда шуд. j Гистограммаҳои басомади самти тақсимоти ҳуҷайраҳои IPR дар атрофи P3 (сабзи сабук), P4 (сабзи миёна) ва P5 (сабзи тира). Қиматҳои P тавассути санҷиши ду думдор Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. Тачриба ду маротиба бо натичахои якхела такрор карда шуд.
Аз ин рӯ, мо минбаъд таносуби байни сигнализатсияи GA ва фаъолияти тақсимоти ҳуҷайраҳоро тавассути муайян кардани деворҳои ҳуҷайраҳои навтаъсис ҳангоми таҳлил таҳқиқ кардем (расми 5e). Ин равиш ба мо имкон дод, ки басомад ва самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро чен кунем. Тааҷҷубовар аст, ки мо дарёфтем, ки басомади тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR ва боқимондаи SAM (ғайри IPR, расми 5f) шабеҳ буд, ки нишон медиҳад, ки фарқиятҳо дар сигнализатсияи GA байни ҳуҷайраҳои IPR ва ғайри IPR ба тақсимоти ҳуҷайраҳо ба таври назаррас таъсир намерасонанд. Ин ва таносуби мусбати байни сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоиш моро водор кард, ки оё фаъолияти сигнализатсияи GA метавонад ба самти тақсимоти ҳуҷайра таъсир расонад. Мо самти девори нави ҳуҷайраро ҳамчун кунҷи шадид нисбат ба меҳвари радиалие, ки маркази меристема ва маркази девори нави ҳуҷайраро мепайвандад, чен кардем (Расми 5e-i) ва тамоюли равшани тақсим кардани ҳуҷайраҳоро дар кунҷҳои наздик ба 90 ° нисбат ба меҳвари радиалӣ мушоҳида кардем, ки басомадҳои баландтарин дар 70-80 ° мушоҳида карда мешаванд 8.28 ° (70-80 ° C). (22,62%) (расми 5e,i), ба тақсимоти ҳуҷайраҳо дар самти гирду атроф/кӯл (расми 5ч). Барои тафтиш кардани саҳми сигнализатсияи GA ба ин рафтори тақсимоти ҳуҷайра, мо параметрҳои тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар IPR ва ғайри IPR алоҳида таҳлил кардем (расми 5i). Мо мушоҳида кардем, ки тақсимоти кунҷи тақсимшавӣ дар ҳуҷайраҳои IPR аз он дар ҳуҷайраҳои ғайри IPR ё ҳуҷайраҳои тамоми САМ фарқ мекард, бо ҳуҷайраҳои IPR ҳиссаи бештари тақсимоти ҳуҷайраҳои паҳлӯӣ/давраки ҳуҷайраҳоро нишон медиҳанд, яъне 70–80° ва 80–90° (мутаносибан 33.86% ва 30.71%, Fig5). Ҳамин тариқ, мушоҳидаҳои мо ассотсиатсияро байни сигнализатсияи баланди GA ва самти тақсимоти ҳуҷайраҳо ба самти гирду атроф, монанд ба таносуби байни фаъолияти сигнализатсияи GA ва анизотропияи афзоиш ошкор карданд (расми 5c, d). Барои муайян кардани минбаъдаи нигоҳдории фазоии ин ассотсиатсия, мо самти тақсимотро дар ҳуҷайраҳои IPR дар атрофи примордиум аз P3 чен кардем, зеро баландтарин фаъолияти сигнализатсияи GA дар ин минтақа аз P4 сар карда муайян карда шуд (расми 4). Кунҷҳои тақсимоти IPR дар атрофи P3 ва P4 фарқиятҳои аз ҷиҳати оморӣ муҳимро нишон надоданд, гарчанде ки дар IPR дар атрофи P4 афзоиши басомади тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳо мушоҳида шудааст (расми 5j). Аммо дар ячейкахои IPR дар атрофи Р5 фарки ориентацияи хамвории таксимшавии хучайрахо аз чихати оморй ахамиятнок шуда, басомади таксимоти кундаланг якбора зиёд мешавад (расми 5ж). Якҷоя, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки сигнализатсияи GA метавонад самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар SAM назорат кунад, ки ба гузоришҳои қаблӣ мувофиқат мекунад40,41, ки сигнализатсияи баланди GA метавонад самти паҳлӯии шӯъбаҳои ҳуҷайраҳоро дар IPR ба вуҷуд орад.
Пешгӯӣ карда мешавад, ки ҳуҷайраҳои IPR на ба примордия, балки ба интернодҳо дохил мешаванд2,42,43. Самти кундалии тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR метавонад ба ташкили маъмулии қаторҳои дарозии параллели ҳуҷайраҳои эпидермалӣ дар байни гиреҳҳо оварда расонад. Мушоҳидаҳои дар боло тавсифшуда нишон медиҳанд, ки сигнализатсияи GA эҳтимолан дар ин раванд тавассути танзими самти тақсимоти ҳуҷайра нақш мебозад.
Аз даст додани функсияи якчанд генҳои DELLA боиси вокуниши конститутивии GA мегардад ва мутантҳои делла метавонанд барои санҷиши ин фарзия истифода шаванд44. Мо аввал намунаҳои ифодаи панҷ генҳои DELLA-ро дар SAM таҳлил кардем. Омезиши транскрипсияи хатти GUS45 нишон дод, ки GAI, RGA, RGL1 ва RGL2 (ба андозаи камтар) дар SAM ифода карда шудаанд (Расми 11a-d). Гибридизатсияи in situ минбаъд нишон дод, ки GAI mRNA махсусан дар гулҳои примордия ва инкишофёбанда ҷамъ мешавад (Расми иловагӣ 11e). RGL1 ва RGL3 mRNA дар саросари сақфи SAM ва дар гулҳои кӯҳна ошкор карда шуданд, дар ҳоле ки RGL2 mRNA дар минтақаи сарҳадӣ фаровонтар буд (расми иловагӣ 11f-h). Тасвири конфокалии pRGL3 :: RGL3-GFP SAM ифодаи мушоҳидашудаи гибридизатсияи in situро тасдиқ кард ва нишон дод, ки протеини RGL3 дар қисми марказии SAM ҷамъ мешавад (расми 11i). Бо истифода аз хати pRGA::GFP-RGA, мо инчунин дарёфтем, ки сафедаи RGA дар SAM ҷамъ мешавад, аммо фаровонии он дар сарҳад аз P4 сар карда коҳиш меёбад (Расми иловагӣ 11j). Қобили зикр аст, ки намунаҳои ифодаи RGL3 ва RGA бо фаъолияти баландтари сигнализатсияи GA дар IPR мувофиқанд, ки аз ҷониби qmRGA муайян карда шудааст (расми 4). Ғайр аз он, ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ҳама DELLAҳо дар SAM ифода шудаанд ва ифодаи онҳо дар маҷмӯъ тамоми SAM-ро фаро мегирад.
Мо минбаъд параметрҳои тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар SAM навъи ваҳшӣ (Лер, назорат) ва мутантҳои gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 делла панҷгонаи (глобалӣ) таҳлил кардем (расми 6а, б). Ҷолиб он аст, ки мо тағироти аз ҷиҳати оморӣ муҳимро дар тақсимоти басомадҳои кунҷи тақсимоти ҳуҷайра дар мутанти глобалии делла дар муқоиса бо навъи ваҳшӣ мушоҳида кардем (расми 6c). Ин тағирот дар мутант глобалии делла аз ҳисоби афзоиши басомади кунҷҳои 80-90° (34,71% нисбат ба 24,55%) ва ба андозаи камтар, кунҷҳои 70–80° (23,78% бар зидди 20,18%), яъне мувофиқ ба тақсимоти ҳуҷайраҳои трансверсивӣ (расми 6c) буд. Басомади тақсимоти ғайриманқул (0-60 °) низ дар мутант глобалии делла камтар буд (расми 6c). Басомади тақсимоти ҳуҷайраҳои transverse дар SAM мутант глобалии делла ба таври назаррас зиёд шуд (расми 6б). Басомади тақсимоти ҳуҷайраҳои transverse дар IPR низ дар мутант глобалии делла нисбат ба навъи ваҳшӣ баландтар буд (расми 6d). Берун аз минтақаи IPR, навъи ваҳшӣ тақсимоти якхелаи кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраҳо дошт, дар ҳоле ки мутант глобалии делла тақсимоти тангенсиалӣ ба монанди IPR бартарӣ медод (расми 6e). Мо инчунин самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар SAM мутантҳои панҷгонаи ga2 оксидаза (ga2ox) муайян кардем (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ва ga2ox6-2), заминаи мутантии GA-ғайрифаъол, ки дар он GA ҷамъ мешавад. Мутобиқи афзоиши сатҳҳои GA, SAM аз inflorescence муттанти панҷгонаи ga2ox аз Col-0 калонтар буд (Расми 12a, b) ва дар муқоиса бо Col-0, панҷгонаи ga2ox SAM тақсимоти ба таври возеҳ фарқи кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраро нишон дод, бо афзоиши басомади кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраҳо аз ° 0 то 50 ° афзоиш ёфт. тақсимот (расми иловагӣ 12a–c). Ҳамин тариқ, мо нишон медиҳем, ки фаъолсозии конститутсионии сигнализатсияи GA ва ҷамъшавии GA тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳоро дар IPR ва боқимондаи SAM ба вуҷуд меорад.
a, b визуализатсияи 3D қабати L1-и PI-оғушта Лер (а) ва мутант глобалии делла (б) SAM бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ. Деворҳои нави ҳуҷайраҳое, ки дар САМ (вале на ибтидоӣ) дар тӯли 10 соат ташаккул ёфтаанд, мувофиқи арзишҳои кунҷи онҳо нишон дода ва ранг карда мешаванд. Вуруд SAM-ро дар соати 0 нишон медиҳад. Сатри ранг дар кунҷи рости поён нишон дода мешавад. Тир дар (б) ба мисоли файлҳои ҳуҷайраи мувофиқ дар мутант глобалии делла ишора мекунад. Тачриба ду маротиба бо натичахои якхела такрор карда шуд. Муқоисаи тақсимоти басомади самтҳои тақсимоти ҳуҷайра дар тамоми SAM (d), IPR (e) ва ғайри IPR (f) байни Лер ва глобалӣ. Арзишҳои P бо истифода аз санҷиши ду думдор Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд. f, g визуализатсияи 3D тасвирҳои конфокалии SAM-и PI оғуштаи Col-0 (i) ва pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) растаниҳои трансгенӣ. Панелҳо (а, б) деворҳои нави ҳуҷайраҳоро нишон медиҳанд (вале на примордия), ки дар САМ дар давоми 10 соат ташаккул ёфтаанд. Тачриба ду маротиба бо натичахои якхела такрор карда шуд. h–j Муқоисаи тақсимоти басомади самтҳои тақсимоти ҳуҷайра дар тамоми SAM (h), IPR (i) ва ғайри IPR (j) байни растаниҳои Col-0 ва pCUC2::gai-1-VENUS. Қиматҳои P бо истифода аз санҷиши ду думдор Колмогоров-Смирнов ба даст оварда шуданд.
Мо минбаъд таъсири ҷилавгирӣ аз сигнализатсияи GA-ро махсусан дар IPR озмоиш кардем. Бо ин мақсад, мо промоутери котиледон 2 (CUC2) -ро барои рондани ифодаи сафедаи манфии бартаридоштаи gai-1, ки ба VENUS омехта шудааст (дар хати pCUC2::gai-1-VENUS) истифода бурдем. Дар SAM-и навъи ваҳшӣ, промоутер CUC2 ифодаи аксари IPRҳоро дар SAM, аз ҷумла ҳуҷайраҳои сарҳадӣ, аз P4 сар мекунад ва ифодаи мушаххаси шабеҳ дар растаниҳои pCUC2::gai-1-VENUS мушоҳида шудааст (нигаред ба поён). Тақсимоти кунҷҳои тақсимоти ҳуҷайраҳо дар саросари SAM ё IPR аз pCUC2::gai-1-VENUS растаниҳо аз намуди ваҳшӣ ба таври назаррас фарқ надошт, гарчанде ки ғайричашмдошт мо дарёфтем, ки ҳуҷайраҳои бе IPR дар ин растаниҳо дар басомади баландтари 80-90 ° тақсим мешаванд (расми 6f-j).
Пешниҳод шудааст, ки самти тақсимоти ҳуҷайра аз геометрияи САМ, бахусус фишори кашиш, ки аз каҷшавии бофта ба вуҷуд меояд46 вобаста аст. Аз ин рӯ, мо пурсидем, ки оё шакли SAM дар растаниҳои глобалии делла ва pCUC2::gai-1-VENUS тағир ёфтааст ё не. Тавре ки қаблан хабар дода шуда буд12, андозаи муттанти глобалии делла аз андозаи ваҳшӣ калонтар буд (расми иловагӣ 13a, b, d). Гибридизатсияи in situ аз CLV3 ва STM RNA васеъшавии меристемаро дар мутантҳои делла тасдиқ кард ва минбаъд васеъшавии паҳлуи чароғдони ҳуҷайраро нишон дод (расми иловагӣ 13e, f, h, i). Аммо, каҷравии SAM дар ҳарду генотип шабеҳ буд (Расми иловагӣ 13k, m, n, p). Мо афзоиши шабеҳи ҳаҷмро дар мутант чоргонаи gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 делла бидуни тағирёбии каҷ дар муқоиса бо навъи ваҳшӣ мушоҳида кардем (Расми иловагӣ 13c, d, g, j, l, o, p). Ба басомади самти тақсимоти ҳуҷайраҳо низ дар мутантҳои чоргонаи делла таъсир расонд, аммо нисбат ба мутантҳои монолитии делла ба андозаи камтар таъсир расонд (Расми иловагӣ 12d-f). Ин таъсири истфода, дар баробари набудани таъсир ба каҷравӣ, аз он шаҳодат медиҳад, ки фаъолияти боқимондаи RGL3 дар муттанти чоргонаи Делла тағиротро дар самти тақсимоти ҳуҷайраҳо, ки дар натиҷаи гум шудани фаъолияти DELLA ба вуҷуд омадааст, маҳдуд мекунад ва тағирот дар тақсимоти паҳлӯии ҳуҷайраҳо дар посух ба тағирот дар фаъолияти сигнализатсияи GA, на тағирот дар геометрияи SAM. Тавре ки дар боло тавсиф карда шудааст, промоутери CUC2 ифодаи IPR-ро дар SAM оғоз мекунад (Расми иловагӣ 14a, b) ва баръакс, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM андозаи кам дошт, аммо каҷравии баландтар дошт (Расми иловагӣ 14c-h). Ин таѓйир дар морфологияи pCUC2::gai-1-VENUS SAM метавонад ба таќсимоти гуногуни фишорњои механикї дар муќоиса бо навъи вањшї оварда расонад, ки дар он фишорњои баланди гирду атроф дар масофаи кўтоњтар аз маркази SAM сар мешаванд47. Интихобан, тағирот дар морфологияи pCUC2::gai-1-VENUS SAM метавонад аз тағирёбии хосиятҳои механикии минтақавӣ, ки бо ифодаи трансген ба вуҷуд омадаанд48 ба вуҷуд омада бошад. Дар ҳарду ҳолат, ин метавонад таъсири тағиротро дар сигнализатсияи GA қисман ҷуброн кунад, эҳтимолияти тақсим кардани ҳуҷайраҳо дар самти даврӣ/кӯлӣ ва шарҳи мушоҳидаҳои мо.
Якҷоя гирифта, маълумоти мо тасдиқ мекунанд, ки сигнализатсияи баландтари GA дар самти паҳлуи ҳавопаймои тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR нақши фаъол мебозад. Онҳо инчунин нишон медиҳанд, ки каҷшавии меристема инчунин ба самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR таъсир мерасонад.
Самти гардиши ҳамвории тақсимшавӣ дар IPR, аз сабаби фаъолияти баланди сигнализатсияи GA, аз он шаҳодат медиҳад, ки GA як файли ҳуҷайраи радиалиро дар эпидермис дар дохили SAM пешакӣ ташкил мекунад, то созмони ҳуҷайраро, ки баъдтар дар гиреҳи эпидермалӣ пайдо мешавад, муайян кунад. Дар ҳақиқат, чунин файлҳои ҳуҷайра дар тасвирҳои SAM мутантҳои глобалии делла зуд-зуд намоён буданд (расми 6б). Ҳамин тариқ, барои омӯзиши минбаъдаи функсияи рушди шакли фазоии сигнализатсияи GA дар SAM, мо барои таҳлили ташкили фазоии ҳуҷайраҳо дар IPR дар намуди ваҳшӣ (Лер ва Кол-0), мутантҳои глобалии делла ва растаниҳои трансгении pCUC2 :: gai-1-VENUS тасвири вақтро истифода бурдем.
Мо дарёфтем, ки qmRGA нишон дод, ки фаъолияти сигнализатсияи GA дар IPR аз P1/P2 зиёд шуда, дар P4 ба авҷи худ расид ва ин намуна бо мурури замон доимӣ монд (расми 4a-f ва расми иловагӣ 8c-f, k). Барои таҳлили ташкили фазоии ҳуҷайраҳо дар IPR бо афзоиши сигнали GA, мо ҳуҷайраҳои Ler IPR-ро дар боло ва ба паҳлӯҳои P4 мувофиқи сарнавишти рушди онҳо, ки 34 соат пас аз мушоҳидаи аввал таҳлил шудааст, яъне беш аз ду маротиба пластидӣ, ки ба мо имкон медиҳад, ки ҳуҷайраҳои IPR ҳангоми рушди ибтидоӣ аз P1/P2 то P4 пайгирӣ кунем. Мо се рангҳои гуногунро истифода бурдем: зард барои он ҳуҷайраҳое, ки ба primordium дар наздикии P4 муттаҳид шудаанд, сабз барои онҳое, ки дар IPR буданд ва арғувон барои онҳое, ки дар ҳарду раванд иштирок мекунанд (расми 7a–c). Дар t0 (0 соат), 1-2 қабати ҳуҷайраҳои IPR дар пеши P4 намоён буданд (расми 7а). Тавре интизор мерафт, вақте ки ин ҳуҷайраҳо тақсим мешаванд, онҳо ин корро асосан тавассути ҳамвории тақсимшавӣ анҷом доданд (расм. 7а–в). Натиҷаҳои шабеҳ бо истифода аз Col-0 SAM ба даст оварда шуданд (тамаркуз ба P3, ки қабатҳои сарҳади он ба P4 дар Лер монанд аст), гарчанде ки дар ин генотип қабати дар сарҳади гулҳо ташаккулёфта ҳуҷайраҳои IPR-ро зудтар пинҳон кард (расми 7g-i). Ҳамин тариқ, шакли тақсимоти ҳуҷайраҳои IPR ҳуҷайраҳоро ба қатори радиалӣ, ба монанди дар байни гиреҳҳо пешакӣ ташкил мекунад. Ташкили қаторҳои радиалӣ ва ҷойгиршавии ҳуҷайраҳои IPR дар байни узвҳои пайдарпай аз он шаҳодат медиҳанд, ки ин ҳуҷайраҳо авлоди байни гиреҳҳо мебошанд.
Дар ин ҷо, мо як биосенсори сигнализатсияи GA-ро, qmRGA-ро таҳия кардем, ки имкон медиҳад харитаи миқдории фаъолияти сигнализатсияи GA, ки дар натиҷаи консентратсияи якҷояи ретсепторҳои GA ва GA ба вуҷуд меояд ва ҳангоми кам кардани дахолат ба роҳҳои эндогении сигнализатсия ва ба ин васила маълумот дар бораи функсияи GA дар сатҳи ҳуҷайра таъмин карда шавад. Бо ин мақсад, мо як протеини тағирёфтаи DELLA, mRGA сохтем, ки қобилияти пайваст кардани шарикони мутақобилаи DELLA-ро гум кардааст, аммо ба протеолизи бо GA ҳассос боқӣ мемонад. qmRGA ба тағйироти ҳам экзогенӣ ва ҳам эндогенӣ дар сатҳҳои GA вокуниш нишон медиҳад ва хосиятҳои ҳассоси динамикии он имкон медиҳад, ки баҳодиҳии тағироти фазо-вақтӣ дар фаъолияти сигнализатсияи GA ҳангоми рушд. qmRGA инчунин як асбоби хеле чандир аст, зеро онро метавон ба бофтаҳои гуногун тавассути тағир додани промоутер, ки барои ифодаи он истифода мешавад (агар лозим бошад) мутобиқ кард ва бо назардошти табиати ҳифзшудаи роҳи сигнализатсияи GA ва мотиви PFYRE дар байни ангиоспермҳо, эҳтимол дорад, ки он ба дигар намудҳо интиқол дода шавад22. Мутобиқи ин, мутацияи муодили протеини биринҷи SLR1 DELLA (HYY497AAA) инчунин нишон дода шуд, ки фаъолияти репрессори афзоиши SLR1-ро коҳиш медиҳад ва дар ҳоле ки таназзули миёнаравии GA-ро, ки ба mRGA23 монанд аст, каме коҳиш медиҳад. Қобили зикр аст, ки таҳқиқоти охирин дар Арабидопсис нишон доданд, ки як мутатсияи аминокислотаҳои аминокислотаҳо дар домени PFYRE (S474L) фаъолияти транскрипсияи RGA-ро бе таъсир расонидан ба қобилияти он дар робита бо шарикони омили транскрипсия тағйир додааст50. Гарчанде ки ин мутация ба 3 ивазкунандаи аминокислотаҳои дар mRGA мавҷудбуда хеле наздик аст, тадқиқотҳои мо нишон медиҳанд, ки ин ду мутатсия хусусиятҳои фарқкунандаи DELLA-ро тағир медиҳанд. Гарчанде ки аксари шарикони омили транскрипсия ба доменҳои LHR1 ва SAW-и DELLA26,51 мепайванданд, баъзе аминокислотаҳои ҳифзшуда дар домени PFYRE метавонанд ба эътидол овардани ин мутақобила кӯмак расонанд.
Рушди байни гиреҳҳо як хислати калидӣ дар меъмории растанӣ ва баланд бардоштани ҳосилнокӣ мебошад. qmRGA фаъолияти баландтари сигнализатсияи GA-ро дар ҳуҷайраҳои пешгузаштаи IPR нишон дод. Бо омезиши тасвири миқдорӣ ва генетика, мо нишон додем, ки намунаҳои сигнализатсияи GA дар эпидермиси SAM ҳавопаймоҳои тақсимоти ҳуҷайраҳои даврашакл / гардишро ҷойгир мекунанд ва созмони тақсимоти ҳуҷайраҳоро барои рушди байни гиреҳҳо ташаккул медиҳанд. Якчанд танзимгарони самти тақсимоти ҳуҷайраҳо ҳангоми рушд муайян карда шудаанд52,53. Кори мо намунаи равшани он аст, ки чӣ гуна фаъолияти сигнализатсияи GA ин параметри ҳуҷайраро танзим мекунад. DELLA метавонад бо комплексҳои сафедаи қаблӣ мутақобила кунад41, аз ин рӯ сигнализатсия GA метавонад самти тақсимоти ҳуҷайраҳоро тавассути таъсири мустақим ба самти микротубулҳои кортикалӣ танзим кунад40,41,54,55. Мо ба таври ғайричашмдошт нишон додем, ки дар SAM таносуби фаъолияти сигнализатсияи баландтари GA на дарозшавӣ ё тақсимоти ҳуҷайраҳо, балки танҳо анизотропияи афзоиш буд, ки бо таъсири мустақими GA ба самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR мувофиқат мекунад. Бо вуҷуди ин, мо истисно карда наметавонем, ки ин таъсир метавонад ғайримустақим бошад, масалан, миёнаравӣ тавассути нармкунии девори ҳуҷайра, ки аз ҷониби GA ба вуҷуд омадааст56. Тағирот дар хосиятҳои девори ҳуҷайра фишори механикиро ба вуҷуд меорад57,58, ки он инчунин метавонад ба самти тақсимоти ҳуҷайра тавассути таъсир ба самти микротубулҳои кортикалӣ таъсир расонад39,46,59. Таъсири якҷояи фишори механикии аз ҷониби GA ба вуҷуд омада ва танзими мустақими самти микротюбулҳо аз ҷониби GA метавонанд дар тавлиди як шакли мушаххаси самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар IPR барои муайян кардани интернодҳо ҷалб карда шаванд ва барои санҷиши ин идея таҳқиқоти минбаъда лозиманд. Ба ҳамин монанд, таҳқиқоти қаблӣ аҳамияти сафедаҳои DELLA-и мутақобилаи TCP14 ва 15-ро дар назорати ташаккули байни гиреҳҳо қайд карданд60,61 ва ин омилҳо метавонанд дар амали GA дар якҷоягӣ бо BREVIPEDICELLUS (BP) ва PENNYWISE (PNY), ки рушди байни гиреҳҳоро танзим мекунанд ва нишон доданд, ки ба сигнализатсия GA222 таъсир мерасонанд. Бо назардошти он, ки DELLAҳо бо роҳҳои сигнализатсияи брассиностероид, этилен, кислотаи жасмонӣ ва кислотаи абсцисикӣ (ABA) мутақобила мекунанд63,64 ва ин гормонҳо метавонанд ба самти микротубулҳо таъсир расонанд65, таъсири GA ба самти тақсимоти ҳуҷайраҳо низ метавонад тавассути дигар гормонҳо миёнаравӣ карда шавад.
Тадқиқотҳои барвақти ситологӣ нишон доданд, ки ҳам минтақаҳои дарунӣ ва ҳам берунии Arabidopsis SAM барои рушди интернодҳо заруранд2,42. Далели он, ки GA тақсимоти ҳуҷайраҳоро дар бофтаҳои ботинӣ фаъол танзим мекунад12 вазифаи дугонаи GA-ро дар танзими меристема ва андозаи байнинодҳо дар SAM дастгирӣ мекунад. Намунаи тақсимоти самти ҳуҷайраҳо инчунин дар бофтаи ботинии SAM ба таври қатъӣ танзим карда мешавад ва ин танзим барои афзоиши поя муҳим аст52. Муайян кардани он ҷолиб хоҳад буд, ки оё GA инчунин дар самти самти тақсимоти ҳуҷайраҳо дар созмони дохилии SAM нақш мебозад ва ба ин васила мушаххасот ва рушди интернодҳоро дар дохили SAM ҳамоҳанг мекунад.
Растаниҳо in vitro дар хок ё 1x Мурашиге-Ског (MS) муҳити зист (Дучефа), ки бо 1% сахароза ва 1% агар (Сигма) дар шароити стандартӣ (16 соат рӯшноӣ, 22 °C) илова карда шудаанд, ба истиснои таҷрибаҳои гипокотил ва афзоиши реша, ки дар он ниҳолҳо дар зери нури амудӣ ва 2 °C дар зери нури доимӣ парвариш карда мешаванд. Барои таҷрибаҳои нитрат, растаниҳо дар муҳити тағйирёфтаи MS (миёнаи растании bioWORLD) парвариш карда шуданд, ки бо нитрати мувофиқ (0 ё 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцинат, 1% сахароза ва 1% А-агар (Сигма) дар шароити рӯзона.
GID1a cDNA, ки ба pDONR221 ворид карда шудааст, бо pDONR P4-P1R-pUBQ10 ва pDONR P2R-P3-mCherry ба pB7m34GW барои тавлиди pUBQ10::GID1a-mCherry дубора муттаҳид карда шуд. ДНК-и IDD2, ки ба pDONR221 ворид карда шудааст, ба pB7RWG266 дубора муттаҳид карда шуд, то p35S: IDD2-RFP тавлид кунад. Барои тавлиди pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, порчаи 3,9 кб дар болооби минтақаи рамзгузории GID1b ва порчаи 4,7 кб дорои cDNA GID1b (1,3 кб) ва терминатор (3,4 кб) аввал бо истифода аз праймерҳо дар P3-R4 пурқувват карда шуданд ва сипас дар PD14 илова карда шуданд. (Thermo Fisher Scientific) ва pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) мутаносибан ва дар ниҳоят бо pDONR221 2xmTQ268 ба вектори ҳадафи pGreen 012567 бо истифода аз клонкунии Gateway пайваст карда шуданд. Барои тавлиди pCUC2::LSSmOrange, пайдарпаии промотори CUC2 (3229 бит дар боло аз ATG) ва пас аз пайдарпаии рамзгузории бузурги mOrange-и Стокс ивазшуда (LSSmOrange)69 бо сигнали локализатсияи ҳастаии N7 ва терминатори транскрипсияи NOS бо истифода аз вектори ҳадафи pGreenfra-3 пайваст карда шуданд. системаи рекомбинатсия (Invitrogen). Вектори бинарии растанӣ ба штамми Agrobacterium tumefaciens GV3101 ворид карда шуд ва мутаносибан ба баргҳои Nicotiana benthamiana бо усули инфилтратсияи Agrobacterium ва ба Arabidopsis thaliana Col-0 бо усули ғарқкунии гулҳо ворид карда шуд. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ва pCLV3::mCherry-NLS qmRGA мутаносибан аз наслҳои F3 ва F1 салибҳои мувофиқ ҷудо карда шуданд.
Гибридизатсияи РНК in situ дар нӯги навдаҳои тақрибан 1 см дароз карда шуд72, ки ҷамъоварӣ карда шуданд ва фавран дар маҳлули FAA (3,7% формальдегид, 5% кислотаи сирко, 50% этанол) то 4 °C сард карда шуданд. Пас аз коркарди вакууми 2 × 15 дақиқа, фиксатор иваз карда шуд ва намунаҳо як шабонарӯз инкубатор карда шуданд. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ва RGL3 cDNAs ва зондҳои антисенс ба 3′-UTR-ҳои онҳо бо истифода аз праймерҳои дар Ҷадвали иловагии 3 нишондодашуда, ки Розиер ва дигарон 73 тавсиф кардаанд, синтез карда шуданд. Зондҳои бо тамғагузоришудаи дигоксиген бо истифода аз антителоҳои дигоксигенин (3000-қабата; Рақа, рақами каталог: 11 093 274 910) ва бахшҳо бо 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфат (BCIPtroblue, dilution) ранг карда шуданд. (БМТ, маҳлули 200-карата).
Вақти фиристодан: феврал-10-2025