Дар ин таҳқиқот, таъсири ҳавасмандкунандаи табобати якҷояитанзимгарони афзоиши растанӣ(2,4-D ва кинетин) ва нанозарраҳои оксиди оҳан (Fe₃O₄-NPs) дар морфогенези in vitro ва истеҳсоли метаболитҳои дуюмдараҷа дар *Hypericum perforatum* L. таҳқиқ карда шуданд. Табобати оптимизатсияшуда [2,4-D (0.5 мг/л) + кинетин (2 мг/л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/л)] параметрҳои афзоиши растаниро ба таври назаррас беҳтар кард: баландии растанӣ 59.6%, дарозии реша 114.0%, шумораи навдаҳо 180.0% ва вазни тозаи каллус 198.3% дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ афзоиш ёфт. Ин табобати якҷоя инчунин самаранокии барқароркуниро (50.85%) ва миқдори гиперисинро 66.6% афзоиш дод. Таҳлили GC-MS миқдори зиёди гиперозид, β-патолин ва спирти сетилро нишон дод, ки 93,36% масоҳати умумии қулларо ташкил медиҳад, дар ҳоле ки миқдори умумии фенолҳо ва флавоноидҳо то 80,1% афзоиш ёфтааст. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки танзимгарони афзоиши растанӣ (PGRs) ва нанозарраҳои Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) тавассути ҳавасмандгардонии органогенез ва ҷамъшавии пайвастагиҳои биоактивӣ таъсири синергетикӣ мерасонанд, ки ин як стратегияи умедбахш барои беҳтар кардани биотехнологии растаниҳои доруворӣ мебошад.
Равғани Сент-Ҷон (Hypericum perforatum L.), ки бо номи Равғани Сент-Ҷон низ маъруф аст, як гиёҳи бисёрсолаи алафии оилаи Hypericaceae мебошад, ки арзиши иқтисодӣ дорад.[1] Ҷузъҳои эҳтимолии биоактивии он иборатанд аз танинҳои табиӣ, ксантонҳо, флороглюцинол, нафталиндиантрон (гиперин ва псевдогиперин), флавоноидҳо, кислотаҳои фенолӣ ва равғанҳои эфирӣ.[2,3,4] Равғани Сент-Ҷонро бо усулҳои анъанавӣ парвариш кардан мумкин аст; аммо, мавсимии усулҳои анъанавӣ, сабзиши пасти тухмӣ ва осебпазирӣ ба бемориҳо имконияти онро барои парвариши васеъ ва ташаккули пайвастаи метаболитҳои дуюмдараҷа маҳдуд мекунад.[1,5,6]
Ҳамин тариқ, парвариши бофтаҳои in vitro усули муассир барои афзоиши босуръати растанӣ, ҳифзи захираҳои генплазма ва афзоиши ҳосили пайвастагиҳои доруворӣ ҳисобида мешавад [7, 8]. Танзимгарони афзоиши растанӣ (PGRs) дар танзими морфогенез нақши муҳим доранд ва барои парвариши каллус ва тамоми организмҳо дар in vitro заруранд. Беҳтар кардани консентратсия ва комбинатсияҳои онҳо барои анҷом додани бомуваффақияти ин равандҳои рушд муҳим аст [9]. Аз ин рӯ, фаҳмидани таркиб ва консентратсияи мувофиқи танзимгарон барои беҳтар кардани афзоиш ва қобилияти барқароркунии гули Сент-Ҷон (H. perforatum) муҳим аст [10].
Нанозарраҳои оксиди оҳан (Fe₃O₄) як синфи нанозарраҳо мебошанд, ки барои парвариши бофтаҳо таҳия шудаанд ё таҳия карда мешаванд. Fe₃O₄ дорои хосиятҳои назарраси магнитӣ, мутобиқати хуби биологӣ ва қобилияти мусоидат ба афзоиши растанӣ ва коҳиш додани стресси экологӣ мебошад, аз ин рӯ, он дар тарҳҳои парвариши бофтаҳо таваҷҷӯҳи зиёдро ҷалб кардааст. Истифодаи эҳтимолии ин нанозарраҳо метавонад беҳсозии парвариши in vitro барои мусоидат ба тақсимоти ҳуҷайраҳо, беҳтар кардани ҷабби маводи ғизоӣ ва фаъолсозии ферментҳои антиоксидантӣ бошад [11].
Гарчанде ки нанозарраҳо таъсири хуби ҳавасмандкунандаро ба афзоиши растанӣ нишон додаанд, таҳқиқот оид ба истифодаи якҷояи нанозарраҳои Fe₃O₄ ва танзимгарони оптимизатсияшудаи афзоиши растанӣ дар *H. perforatum* камёб боқӣ мемонанд. Барои пур кардани ин холигии дониш, ин таҳқиқот таъсири якҷояи онҳоро ба морфогенези in vitro ва истеҳсоли метаболитҳои дуюмдараҷа арзёбӣ кард, то фаҳмишҳои навро барои беҳтар кардани хусусиятҳои растаниҳои шифобахш пешниҳод кунад. Аз ин рӯ, ин таҳқиқот ду ҳадаф дорад: (1) беҳтар кардани консентратсияи танзимгарони афзоиши растанӣ барои мусоидат ба самаранокии ташаккули каллус, барқароршавии навдаҳо ва решаканшавӣ дар in vitro; ва (2) арзёбии таъсири нанозарраҳои Fe₃O₄ ба параметрҳои афзоиш дар in vitro. Нақшаҳои оянда арзёбии сатҳи зиндамонии растаниҳои барқароршударо дар давраи мутобиқшавӣ (in vitro) дар бар мегиранд. Интизор меравад, ки натиҷаҳои ин таҳқиқот самаранокии микропаҳншавии *H. perforatum*-ро ба таври назаррас беҳтар кунанд ва бо ин васила ба истифодаи устувор ва татбиқи биотехнологии ин растании муҳими шифобахш мусоидат кунанд.
Дар ин таҳқиқот, мо эксплантҳои баргро аз растаниҳои яксолаи виски Сент-Ҷон (растаниҳои модарӣ), ки дар саҳро парвариш карда мешаванд, ба даст овардем. Ин эксплантҳо барои беҳтар кардани шароити парвариши in vitro истифода шуданд. Пеш аз парвариш, баргҳо дар зери оби равон барои чанд дақиқа бодиққат шуста шуданд. Сипас, сатҳҳои эксплант бо роҳи ғӯтонидан дар этаноли 70% барои 30 сония дезинфексия карда шуданд ва сипас дар маҳлули 1,5% гипохлорити натрий (NaOCl), ки чанд қатра Tween 20 дошт, барои 10 дақиқа ғӯтонида шуданд. Дар ниҳоят, эксплантҳо пеш аз интиқол ба муҳити нави парвариш се маротиба бо оби стерилизатсияшудаи стерилизатсияшуда шуста шуданд.
Дар тӯли чор ҳафтаи оянда, параметрҳои барқароршавии навдаҳо, аз ҷумла суръати барқароршавӣ, шумораи навдаҳо дар як эксплант ва дарозии навдаҳо чен карда шуданд. Вақте ки навдаҳои барқароршуда ба дарозии ҳадди аққал 2 см расиданд, онҳо ба муҳити решаканкунӣ, ки аз муҳити нимқуввати MS, кислотаи индолбутирии 0,5 мг/л (IBA) ва 0,3% резини гуар иборат буд, интиқол дода шуданд. Культураи решаканкунӣ се ҳафта идома ёфт, ки дар ин муддат суръати решаканкунӣ, шумораи реша ва дарозии реша чен карда шуданд. Ҳар як коркард се маротиба такрор карда шуд ва дар як такрор 10 эксплант парвариш карда шуд, ки дар як табобат тақрибан 30 эксплант ҳосил дод.
Баландии растанӣ бо сантиметр (см) бо истифода аз хаткӯркунак аз пояи растанӣ то нӯги барги баландтарин чен карда шуд. Дарозии реша фавран пас аз бодиққат тоза кардани ниҳолҳо ва тоза кардани муҳити афзоиш бо миллиметр (мм) чен карда шуд. Шумораи навдаҳо барои як эксплант мустақиман дар ҳар як растанӣ ҳисоб карда шуд. Шумораи доғҳои сиёҳ дар баргҳо, ки бо номи гиреҳҳо маълуманд, бо чашм чен карда шуд. Ин гиреҳҳои сиёҳ боварӣ доранд, ки ғадудҳои дорои гиперисин ё доғҳои оксидӣ мебошанд ва ҳамчун нишондиҳандаи физиологии вокуниши растанӣ ба табобат истифода мешаванд. Пас аз тоза кардани тамоми муҳити афзоиш, вазни тару тозаи ниҳолҳо бо истифода аз тарозуи электронӣ бо дақиқии миллиграмм (мг) чен карда шуд.
Усули ҳисоб кардани суръати ташаккули каллус чунин аст: пас аз парвариши эксплантҳо дар муҳите, ки дорои танзимгарони гуногуни афзоиш (киназаҳо, 2,4-D ва Fe3O4) мебошад, ба муддати чор ҳафта, шумораи эксплантҳое, ки қодиранд каллусро ташкил диҳанд, ҳисоб карда мешаванд. Формулаи ҳисоб кардани суръати ташаккули каллус чунин аст:
Ҳар як табобат се маротиба такрор карда шуд ва дар ҳар як такрор ҳадди аққал 10 эксплант тафтиш карда шуд.
Суръати барқароршавӣ таносуби бофтаи каллусро инъикос мекунад, ки пас аз марҳилаи ташаккули каллус раванди табақабандии навдаро бомуваффақият ба анҷом мерасонад. Ин нишондиҳанда қобилияти бофтаи каллусро барои табдил ёфтан ба бофтаи табақабандишуда ва афзоиш ёфтан ба узвҳои нави растанӣ нишон медиҳад.
Коэффитсиенти решаканӣ нисбати шумораи шохаҳое мебошад, ки қодиранд решакан шаванд, ба шумораи умумии шохаҳо. Ин нишондиҳанда муваффақияти марҳилаи решаканкуниро инъикос мекунад, ки дар микропаҳнкунӣ ва афзоиши растанӣ муҳим аст, зеро решакании хуб ба беҳтар зинда мондани ниҳолҳо дар шароити афзоиш мусоидат мекунад.
Пайвастагиҳои гиперисин бо 90% метанол истихроҷ карда шуданд. Панҷоҳ мг маводи хушки растанӣ ба 1 мл метанол илова карда шуд ва ба муддати 20 дақиқа дар 30 кГц дар тозакунандаи ултрасадо (модели A5120-3YJ) дар ҳарорати хонагӣ дар торикӣ бо сонизатсия гузаронида шуд. Пас аз сонизатсия, намуна бо суръати 6000 чархзанӣ дар як дақиқа барои 15 дақиқа сентрифуга карда шуд. Қисми болоии қабат ҷамъоварӣ карда шуд ва ҷабби гиперисин дар 592 нм бо истифода аз спектрофотометри Plus-3000 S мувофиқи усули тавсифкардаи Консейсао ва ҳамкорон [14] чен карда шуд.
Аксари табобатҳо бо танзимгарони афзоиши растанӣ (PGRs) ва нанозарраҳои оксиди оҳан (Fe₃O₄-NPs) боиси пайдоиши гиреҳҳои сиёҳ дар баргҳои навдаҳои барқароршуда нашуданд. Дар ҳеҷ яке аз табобатҳо бо кинетинҳои 0,5 ё 1 мг/л 2,4-D, 0,5 ё 1 мг/л ё нанозарраҳои оксиди оҳани 1, 2 ё 4 мг/л ягон гиреҳ мушоҳида нашуд. Якчанд комбинатсияҳо афзоиши ночизи рушди гиреҳҳоро нишон доданд (аммо аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок нестанд) дар консентратсияҳои баланди кинетин ва/ё нанозарраҳои оксиди оҳан, ба монанди комбинатсияи 2,4-D (0,5-2 мг/л) бо кинетин (1-1,5 мг/л) ва нанозарраҳои оксиди оҳан (2-4 мг/л). Ин натиҷаҳо дар расми 2 нишон дода шудаанд. Гиреҳҳои сиёҳ ғадудҳои бой аз гиперисинро ифода мекунанд, ки ҳам табиӣ ва ҳам муфиданд. Дар ин таҳқиқот, гиреҳҳои сиёҳ асосан бо қаҳваранг шудани бофтаҳо алоқаманд буданд, ки аз муҳити мусоид барои ҷамъшавии гиперисин шаҳодат медиҳанд. Табобат бо нанозарраҳои 2,4-D, кинетин ва Fe₃O₄ афзоиши каллус, коҳиш ёфтани қаҳварангшавӣ ва афзоиши миқдори хлорофиллро мусоидат кард, ки ин аз беҳтар шудани фаъолияти мубодилаи моддаҳо ва коҳиши эҳтимолии зарари оксидшавӣ шаҳодат медиҳад [37]. Дар ин таҳқиқот таъсири кинетин дар якҷоягӣ бо нанозарраҳои 2,4-D ва Fe₃O₄ ба афзоиш ва инкишофи каллуси вискии Сент-Ҷон арзёбӣ карда шуд (Расми 3a–g). Тадқиқотҳои қаблӣ нишон доданд, ки нанозарраҳои Fe₃O₄ фаъолиятҳои зидди замбӯруғӣ ва зиддимикробӣ доранд [38, 39] ва ҳангоми истифода дар якҷоягӣ бо танзимгарони афзоиши растанӣ, метавонанд механизмҳои дифоъии растаниро ҳавасманд кунанд ва нишондиҳандаҳои стресси ҳуҷайраро коҳиш диҳанд [18]. Гарчанде ки биосинтези метаболитҳои дуюмдараҷа аз ҷиҳати генетикӣ танзим карда мешавад, ҳосили воқеии онҳо аз шароити муҳити зист хеле вобаста аст. Тағйироти метаболикӣ ва морфологӣ метавонанд ба сатҳи метаболитҳои дуюмдараҷа тавассути танзими ифодаи генҳои мушаххаси растанӣ ва вокуниш ба омилҳои муҳити зист таъсир расонанд. Ғайр аз ин, индукторҳо метавонанд фаъолшавии генҳои навро ба вуҷуд оранд, ки дар навбати худ фаъолияти ферментативиро ҳавасманд мекунанд ва дар ниҳоят роҳҳои гуногуни биосинтезиро фаъол мегардонанд ва ба пайдоиши метаболитҳои дуюмдараҷа оварда мерасонанд. Ғайр аз ин, як таҳқиқоти дигар нишон дод, ки кам кардани соя таъсири нури офтобро зиёд мекунад ва бо ин васила ҳарорати рӯзонаро дар муҳити табиии *Hypericum perforatum* баланд мебардорад, ки ин инчунин ба афзоиши ҳосили гиперисин мусоидат мекунад. Дар асоси ин маълумот, ин таҳқиқот нақши нанозарраҳои оҳанро ҳамчун индукторҳои эҳтимолӣ дар парвариши бофта таҳқиқ кард. Натиҷаҳо нишон доданд, ки ин нанозарраҳо метавонанд генҳои иштирокчии биосинтези гесперидинро тавассути ҳавасмандкунии ферментативӣ фаъол созанд, ки боиси афзоиши ҷамъшавии ин пайвастагӣ мегардад (Расми 2). Аз ин рӯ, дар муқоиса бо растаниҳое, ки дар шароити табиӣ мерӯянд, метавон гуфт, ки истеҳсоли чунин пайвастагиҳо дар in vivo низ метавонад вақте афзоиш ёбад, ки стресси мӯътадил бо фаъолшавии генҳое, ки иштирокчии биосинтези метаболитҳои дуюмдараҷа мебошанд, якҷоя карда шавад. Табобатҳои якҷоя одатан ба суръати барқароршавӣ таъсири мусбат мерасонанд, аммо дар баъзе ҳолатҳо ин таъсир суст мешавад. Қобили зикр аст, ки табобат бо 1 мг/л 2,4-D, 1,5 мг/л киназ ва консентратсияҳои гуногун метавонанд мустақилона ва ба таври назаррас суръати барқароршавиро дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ 50,85% афзоиш диҳанд (Расми 4c). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки комбинатсияҳои мушаххаси наногормонҳо метавонанд синергетикӣ амал кунанд, то афзоиши растанӣ ва истеҳсоли метаболитҳоро афзоиш диҳанд, ки барои парвариши бофтаҳои растаниҳои шифобахш аҳамияти калон дорад. Палмер ва Келлер [50] нишон доданд, ки табобати 2,4-D метавонад мустақилона ташаккули каллусро дар St. perforatum ба вуҷуд орад, дар ҳоле ки илова кардани киназ ташаккули каллус ва барқароршавиро ба таври назаррас афзоиш дод. Ин таъсир аз ҳисоби беҳтар шудани тавозуни гормоналӣ ва ҳавасмандгардонии тақсимоти ҳуҷайра ба даст омадааст. Бал ва ҳамкорон [51] муайян карданд, ки табобат бо Fe₃O₄-NP метавонад мустақилона вазифаи ферментҳои антиоксидантро беҳтар кунад ва бо ин васила афзоиши решаро дар St. perforatum мусоидат кунад. Муҳити парваришӣ, ки дорои нанозарраҳои Fe₃O₄ дар консентратсияҳои 0,5 мг/л, 1 мг/л ва 1,5 мг/л мебошад, суръати барқароршавии растаниҳои зағирро беҳтар кард [52]. Истифодаи кинетин, 2,4-дихлорбензотиазолинон ва нанозарраҳои Fe₃O₄ суръати ташаккули каллус ва решаро ба таври назаррас беҳтар кард, аммо таъсири эҳтимолии манфии истифодаи ин гормонҳо барои барқароршавии in vitro бояд ба назар гирифта шавад. Масалан, истифодаи дарозмуддат ё консентратсияи баланди 2,4-дихлорбензотиазолинон ё кинетин метавонад боиси тағирёбии соматикии клоналӣ, стресси оксидативӣ, морфологияи ғайримуқаррарии каллус ё витрификация гардад. Аз ин рӯ, суръати баланди барқароршавӣ ҳатман устувории генетикиро пешгӯӣ намекунад. Ҳамаи растаниҳои барқароршуда бояд бо истифода аз маркерҳои молекулавӣ (масалан, RAPD, ISSR, AFLP) ё таҳлили ситогенетикӣ барои муайян кардани якхелагӣ ва шабоҳати онҳо ба растаниҳои in vivo арзёбӣ карда шаванд [53,54,55].
Ин таҳқиқот бори аввал нишон дод, ки истифодаи якҷояи танзимгарони афзоиши растанӣ (2,4-D ва кинетин) бо нанозарраҳои Fe₃O₄ метавонад морфогенез ва ҷамъшавии метаболитҳои калидии биоактивӣ (аз ҷумла гиперисин ва гиперозид)-ро дар *Hypericum perforatum* беҳтар кунад. Реҷаи табобатии оптимизатсияшуда (1 мг/л 2,4-D + 1 мг/л кинетин + 4 мг/л Fe₃O₄-NPs) на танҳо ташаккули каллус, органогенез ва ҳосили метаболитҳои дуюмдараҷаро ба ҳадди аксар расонд, балки инчунин таъсири сабуки индуксиониро нишон дод, ки эҳтимолан таҳаммулпазирии стресс ва арзиши шифобахшии растаниро беҳтар мекунад. Омезиши нанотехнология ва фарҳанги бофтаи растанӣ платформаи устувор ва самаранокро барои истеҳсоли васеи пайвастагиҳои доруворӣ дар in vitro фароҳам меорад. Ин натиҷаҳо роҳро барои татбиқи саноатӣ ва таҳқиқоти оянда дар бораи механизмҳои молекулавӣ, оптимизатсияи миқдор ва дақиқии генетикӣ ҳамвор мекунанд ва бо ин васила таҳқиқоти бунёдиро дар бораи растаниҳои доруворӣ бо биотехнологияи амалӣ пайваст мекунанд.
Вақти нашр: 12 декабри соли 2025