Доруи зидди антителминт N,N-диэтил-м-толуамид (DEET) гузориш дода шудааст, ки AChE (acetylcholinesterase) -ро боздорад ва дорои хосиятҳои эҳтимолии канцерогенӣ аз сабаби васкуляризатсияи аз ҳад зиёд. Дар ин мақола мо нишон медиҳем, ки DEET махсусан ҳуҷайраҳои эндотелияро ҳавасманд мекунад, ки ангиогенезро пеш мебаранд ва ба ин васила афзоиши варамҳоро афзоиш медиҳанд. DEET равандҳои ҳуҷайраро фаъол мекунад, ки ба ангиогенез оварда мерасонад, аз ҷумла паҳншавӣ, муҳоҷират ва адгезия. Ин бо афзоиши истеҳсоли NO ва ифодаи VEGF дар ҳуҷайраҳои эндотелия алоқаманд аст. Хомӯш кардани M3 ё истифодаи ингибиторҳои фармакологии M3 ҳамаи ин таъсирҳоро аз байн бурд, ки аз он шаҳодат медиҳад, ки ангиогенези аз ҷониби DEET ба вуҷуд омада ба M3 ҳассос аст. Таҷрибаҳо дар бораи сигнализатсияи калсий дар ҳуҷайраҳои эндотелия ва HEK, ки ретсепторҳои M3 аз ҳад зиёд ифода мекунанд, инчунин таҳқиқоти ҳатмӣ ва пайвастшавӣ нишон медиҳанд, ки DEET ҳамчун модулятори аллостерикии ретсепторҳои M3 амал мекунад. Ғайр аз он, DEET AChE-ро бозмедорад ва ба ин васила дастрасии биологии ацетилхолин ва пайвастшавии онро ба ретсепторҳои M3 афзоиш медиҳад ва тавассути танзими аллостерикӣ таъсири проангиогениро тақвият медиҳад.
EC-ҳои ибтидоӣ аз аортаи мушҳои Швейтсария ҷудо карда шуданд. Усули истихроҷ аз протоколи Кобаяши 26 мутобиқ карда шудааст. EC-ҳои мурина дар муҳити EBM-2, ки бо FBS-и 5% гармии ғайрифаъолшуда то гузариши чорум илова карда шудаанд, парвариш карда шуданд.
Таъсири ду консентратсияи DEET ба паҳншавии HUVEC, U87MG ё BF16F10 бо истифода аз маҷмӯаи таҳлили CyQUANT Proliferation Cell (Molecular Probes, C7026) таҳлил карда шуд. Ба таври мухтасар, 5.103 ҳуҷайраҳо дар як чоҳ дар як табақи 96-чоҳ тухмипошак карда шуданд, иҷозат доданд, ки дар як шабонарӯз пайваст шаванд ва сипас бо DEET барои 24 соат коркард карда шаванд. Пас аз хориҷ кардани муҳити афзоиш, ба ҳар як чоҳи микроплата маҳлули ҳатмии рангро илова кунед ва ҳуҷайраҳоро дар 37 °C барои 30 дақиқа инкубатор кунед. Сатҳи флуорессенсия бо истифода аз микропласти микропластини бисёрмоҳаи Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад Вилдбад, Олмон), ки бо филтрҳои ҳаяҷонбахши 485 нм ва филтрҳои эмиссияи 530 нм муҷаҳҳаз шудааст, муайян карда шуд.
HUVEC дар лавҳаҳои 96-чоҳ бо зичии 104 ҳуҷайра дар як чоҳ кошта шуданд. Ҳуҷайраҳо бо DEET барои 24 соат коркард карда шуданд. Зиндагии ҳуҷайра бо истифода аз таҳлили колориметрии MTT (Sigma-Aldrich, M5655) арзёбӣ шуд. Қиматҳои зичии оптикӣ дар як хонандаи микроплатаҳои бисёрмоҳавӣ (Mithras LB940) дар дарозии мавҷи 570 нм ба даст оварда шуданд.
Таъсири DEET бо истифода аз таҳлилҳои ангиогенези in vitro омӯхта шуд. Табобат бо 10-8 М ё 10-5 М DEET ташаккули дарозии капиллярҳоро дар HUVEC зиёд кард (расми 1а, б, сутунҳои сафед). Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, табобат бо консентратсияи DEET аз 10-14 то 10-5 М нишон дод, ки дарозии капиллярҳо ба плато дар 10-8 М DEET расидааст (Расми S2). Дар таъсири проангиогении in vitro HUVEC-ҳои бо DEET коркардшуда дар диапазони консентратсияи 10-8 М ва 10-5 М фарқияти назаррас пайдо нашуд.
Барои муайян кардани таъсири DEET ба неоваскуляризатсия, мо дар vivo таҳқиқоти неоваскуляризатсияро анҷом додем. Пас аз 14 рӯз, мушҳое, ки бо ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ, ки бо 10-8 М ё 10-5 М DEET парвариш карда шудаанд, афзоиши назарраси таркиби гемоглобинро нишон доданд (расми 1c, сутунҳои сафед).
Ғайр аз он, неоваскуляризатсияи аз ҷониби DEET ба вуҷуд омада дар мушҳои ксенографти U87MG омӯхта шуд, ки ҳар рӯз (ip) бо DEET бо вояи маълум, ки консентратсияи плазмаи 10-5 М-ро ба вуҷуд меорад, ки дар одамони дучоршуда муқаррарӣ аст. дар 23. Омосҳои ошкоршаванда (яъне варамҳо >100 мм3) 14 рӯз пас аз ворид кардани ҳуҷайраҳои U87MG ба мушҳо мушоҳида карда шуданд. Дар рӯзи 28, афзоиши варам дар мушҳои бо DEET табобатшуда дар муқоиса бо мушҳои назоратӣ ба таври назаррас афзоиш ёфт (расми 1d, мураббаъҳо). Ғайр аз он, рангкунии CD31-и омосҳо нишон дод, ки DEET майдони капиллярҳоро ба таври назаррас афзоиш додааст, аммо зичии микрорагҳо. (расми 1е—г).
Барои муайян кардани нақши ретсепторҳои мускаринӣ дар паҳншавии DETA, 10-8 М ё 10-5 М DETA дар ҳузури pFHHSiD (10-7 М, антагонисти ресепторҳои интихобшудаи М3) истифода шудааст. Табобати HUVEC. pFHHSiD хосиятҳои пролиферативии DETA-ро дар ҳама консентратҳо комилан бастааст (Ҷадвали 1).
Дар ин шароит, мо инчунин тафтиш кардем, ки оё DEET дарозии капиллярҳоро дар ҳуҷайраҳои HUVEC зиёд мекунад. Ба ҳамин монанд, pFHHSiD ба таври назаррас дарозии капиллярии DEET-ро пешгирӣ кард (расми 1a, b, сутунҳои хокистарӣ). Ғайр аз он, таҷрибаҳои шабеҳ бо M3 siRNA гузаронида шуданд. Гарчанде ки siRNA-и назоратӣ дар пешбурди ташаккули капиллярҳо самаранок набуд, хомӯш кардани ретсептори мускаринии M3 қобилияти DEET-ро барои зиёд кардани дарозии капиллярҳо бекор кард (расми 1а, б, панҷараҳои сиёҳ).
Ғайр аз он, ҳам васкуляризатсияи 10-8 M ё 10-5 M DEET дар in vitro ва неоваскуляризатсия дар vivo пурра аз ҷониби pFHHSiD баста шуданд (расми 1c, d, доираҳо). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки DEET ангиогенезро тавассути роҳи ҳассос ба антагонистҳои ретсепторҳои M3 ё M3 siRNA мусоидат мекунад.
AChE ҳадафи молекулавии DEET мебошад. Доруҳо, ба монанди донепезил, ки ҳамчун ингибиторҳои AChE амал мекунанд, метавонанд ангиогенези EC-ро дар in vitro ва моделҳои ишемияи пои ақиби муш ҳавасманд кунанд14. Мо таъсири ду консентратсияи DEET-ро ба фаъолияти ферментҳои AChE дар HUVEC санҷидем. Консентратсияи паст (10-8 М) ва баланд (10-5 М) DEET фаъолияти эндотелии AChE-ро нисбат ба шароити назорат коҳиш дод (расми 2).
Ҳарду консентратсияи DEET (10-8 М ва 10-5 М) фаъолияти ацетилхолинестеразаро дар HUVEC коҳиш доданд. BW284c51 (10-5 М) ҳамчун назорат барои ингибиторҳои ацетилхолинестераза истифода шудааст. Натиҷаҳо ҳамчун фоизи фаъолияти AChE дар HUVEC, ки бо ду консентратсияи DEET дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои бо воситаи нақлиёт коркардшуда коркард шудаанд, ифода карда мешаванд. Арзишҳо ҳамчун миёнаи ± SEM аз шаш таҷрибаи мустақил ифода карда мешаванд. *p < 0,05 нисбат ба назорат (санҷиши муқоисаи сершумори Крускал-Уоллис ва Данн).
Оксиди нитрат (NO) дар раванди ангиогенӣ иштирок мекунад 33, аз ин рӯ, НЕСТ истеҳсол дар HUVEC-ҳои бо DEET ҳавасмандшуда омӯхта нашудааст. Истеҳсоли NO-и эндотелиии бо DEET коркардшуда нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ зиёд шуд, аммо танҳо дар миқдори 10-8 М ба аҳамият расид (расми 3c). Барои муайян кардани тағироти молекулавӣ, ки истеҳсоли NO-и аз DEET ба вуҷуд омадаро назорат мекунад, ифодаи eNOS ва фаъолсозӣ тавассути blotting Western таҳлил карда шуд. Гарчанде ки табобати DEET ифодаи eNOS-ро тағир надодааст, он фосфоризатсияи eNOS-ро дар макони фаъолгардонии он (Ser-1177) ба таври назаррас афзоиш дод ва дар ҳоле ки макони ингибитории худро (Thr-495) дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои коркарднашуда дар фосфоризатсияи eNOS коҳиш дод (расми 3d). Ғайр аз он, таносуби eNOS-и фосфоризатсияшуда дар макони фаъолсозӣ ва макони ингибиторӣ пас аз ба эътидол овардани миқдори eNOS-и фосфоризатсияшуда ба миқдори умумии фермент ҳисоб карда шуд. Ин таносуб дар HUVEC-ҳои бо ҳар як консентратсияи DEET коркардшуда нисбат ба ҳуҷайраҳои коркарднашуда ба таври назаррас афзоиш ёфт (расми 3d).
Ниҳоят, ифодаи VEGF, яке аз омилҳои асосии проангиогенӣ, тавассути blotting ғарбӣ таҳлил карда шуд. DEET ифодаи VEGF-ро ба таври назаррас афзоиш дод, дар ҳоле ки pFHHSiD ин ифодаро комилан бастааст.
Азбаски таъсири DEET ҳам ба блокадаи фармакологӣ ва ҳам танзими ресепторҳои M3 ҳассос аст, мо фарзияро санҷидем, ки DEET метавонад сигнализатсияи калсийро тақвият диҳад. Тааҷҷубовар аст, ки DEET калсий цитоплазмиро дар HUVEC (маълумот нишон дода нашудааст) ва HEK/M3 (расми 4а, б) барои ҳарду консентратсияи истифодашуда зиёд карда натавонист.
Вақти интишор: Декабр-30-2024