Доруи зидди кирмҳо N, N-диэтил-м-толуамид (DEET) гузориш шудааст, ки AChE (ацетилхолинэстераза)-ро бозмедорад ва дорои хосиятҳои эҳтимолии канцерогенӣ аз сабаби рагҳои аз ҳад зиёд мебошад. Дар ин мақола, мо нишон медиҳем, ки DEET махсусан ҳуҷайраҳои эндотелиалиро ҳавасманд мекунад, ки ангиогенезро мусоидат мекунанд ва бо ин васила афзоиши варамро афзоиш медиҳанд. DEET равандҳои ҳуҷайравиро фаъол мекунад, ки ба ангиогенез, аз ҷумла паҳншавӣ, муҳоҷират ва часпиш оварда мерасонанд. Ин бо афзоиши истеҳсоли NO ва ифодаи VEGF дар ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ алоқаманд аст. Хомӯш кардани M3 ё истифодаи ингибиторҳои фармакологии M3 ҳамаи ин таъсирҳоро аз байн мебарад ва нишон медиҳад, ки ангиогенези аз ҷониби DEET ба вуҷуд омада ба M3 ҳассос аст. Таҷрибаҳое, ки бо сигнализатсияи калсий дар ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ ва HEK, ки аз ҳад зиёд ифодаи ретсепторҳои M3-ро доранд, инчунин таҳқиқоти пайвастшавӣ ва пайвастшавӣ алоқаманданд, нишон медиҳанд, ки DEET ҳамчун модулятори аллостерикии ретсепторҳои M3 амал мекунад. Ғайр аз ин, DEET AChE-ро бозмедорад ва бо ин васила биодастрасии ацетилхолин ва пайвастшавии онро ба ретсепторҳои M3 зиёд мекунад ва таъсири проангиогениро тавассути танзими аллостерикӣ афзоиш медиҳад.
ЭК-ҳои ибтидоӣ аз аортаи мушҳои швейтсарӣ ҷудо карда шуданд. Усули истихроҷ аз протоколи Кобаяши 26 мутобиқ карда шуд. ЭК-ҳои муш дар муҳити EBM-2, ки бо FBS-и 5% ғайрифаъолшудаи гармӣ илова карда шуда буд, то гузариши чорум парвариш карда шуданд.
Таъсири ду консентратсияи DEET ба афзоиши HUVEC, U87MG ё BF16F10 бо истифода аз Маҷмӯаи таҳлили паҳншавии ҳуҷайраҳои CyQUANT (Molecular Probes, C7026) таҳлил карда шуд. Хулоса, 5.103 ҳуҷайра дар як чоҳ дар табақи 96-чоҳӣ шинонда шуда, барои пайваст кардани шабонарӯзӣ гузошта шуданд ва сипас бо DEET барои 24 соат коркард карда шуданд. Пас аз хориҷ кардани муҳити афзоиш, ба ҳар як чоҳи микропластина маҳлули пайвасткунандаи ранг илова кунед ва ҳуҷайраҳоро дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия кунед. Сатҳи флуоресценсия бо истифода аз хонандаи микропластинаи бисёрмодавии Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Олмон), ки бо филтрҳои ангезиши 485 нм ва филтрҳои эмиссияи 530 нм муҷаҳҳаз шудааст, муайян карда шуд.
HUVEC дар табақчаҳои 96-чоҳӣ бо зичии 104 ҳуҷайра дар як чоҳ кишт карда шуданд. Ҳуҷайраҳо ба муддати 24 соат бо DEET коркард карда шуданд. Зиндагии ҳуҷайра бо истифода аз таҳлили колориметрии MTT (Sigma-Aldrich, M5655) арзёбӣ карда шуд. Арзишҳои зичии оптикӣ дар хонандаи микропластинаи бисёрмодавӣ (Mithras LB940) бо дарозии мавҷи 570 нм ба даст оварда шуданд.
Таъсири DEET бо истифода аз таҳлилҳои ангиогенези in vitro омӯхта шуд. Табобат бо 10-8 M ё 10-5 M DEET ташаккули дарозии капиллярҳоро дар HUVEC зиёд кард (Расми 1a, b, сутунҳои сафед). Дар муқоиса бо гурӯҳи назоратӣ, табобат бо консентратсияи DEET аз 10-14 то 10-5 M нишон дод, ки дарозии капиллярҳо дар 10-8 M DEET ба плато расидааст (Расми иловагӣ S2). Дар таъсири проангиогении in vitro HUVEC-ҳое, ки бо DEET дар диапазони консентратсияи 10-8 M ва 10-5 M табобат карда шудаанд, ягон фарқияти назаррас мушоҳида нашуд.
Барои муайян кардани таъсири DEET ба неоваскуляризатсия, мо таҳқиқоти неоваскуляризатсияи in vivo-ро анҷом додем. Пас аз 14 рӯз, мушҳое, ки бо ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ, ки бо 10-8 M ё 10-5 M DEET пешакӣ парвариш карда шудаанд, сӯзандору карда шуданд, афзоиши назарраси миқдори гемоглобинро нишон доданд (Расми 1c, сутунҳои сафед).
Ғайр аз ин, неоваскуляризатсияи аз ҷониби DEET ба вуҷуд омада дар мушҳои ксенотрансплантатсияи U87MG, ки ҳар рӯз (ip) бо DEET бо миқдоре, ки маълум аст консентратсияи плазмавии 10-5 М-ро ба вуҷуд меорад, ки дар одамони гирифтори ин беморӣ муқаррарӣ аст, тазриқ карда шуд. Дар 23. Варамҳои ошкоршаванда (яъне варамҳои >100 мм3) 14 рӯз пас аз тазриқи ҳуҷайраҳои U87MG ба мушҳо мушоҳида карда шуданд. Дар рӯзи 28, афзоиши варам дар мушҳои табобатшуда бо DEET дар муқоиса бо мушҳои назоратӣ ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расми 1d, мураббаъҳо). Ғайр аз ин, рангкунии варамҳои CD31 нишон дод, ки DEET майдони капиллярҳоро ба таври назаррас афзоиш додааст, аммо зичии микрорагҳоро не (Расми 1e-g).
Барои муайян кардани нақши ретсепторҳои мускаринӣ дар афзоиши аз ҷониби DETA ба вуҷуд омада, 10-8 М ё 10-5 М DETA дар ҳузури pFHHSiD (10-7 М, антагонисти интихобкунандаи ретсепторҳои M3) истифода шуд. Табобати HUVEC. pFHHSiD хосиятҳои пролиферативии DETA-ро дар ҳама консентратсияҳо пурра манъ кард (Ҷадвали 1).
Дар чунин шароит, мо инчунин таҳқиқ кардем, ки оё DEET дарозии капиллярҳоро дар ҳуҷайраҳои HUVEC зиёд мекунад. Ба ҳамин монанд, pFHHSiD ба таври назаррас дарозии капиллярҳои аз ҷониби DEET ба вуҷуд омадаро пешгирӣ кард (Расми 1a, b, сутунҳои хокистарӣ). Ғайр аз ин, таҷрибаҳои монанд бо siRNA-и M3 гузаронида шуданд. Гарчанде ки siRNA-и назоратӣ дар мусоидат ба ташаккули капиллярҳо самаранок набуд, хомӯш кардани ретсептори мускаринии M3 қобилияти DEET-ро барои зиёд кардани дарозии капиллярҳо аз байн бурд (Расми 1a, b, сутунҳои сиёҳ).
Ғайр аз ин, ҳам рагҳои хунгарди аз ҷониби 10-8 M ё 10-5 M ба вуҷуд омада дар in vitro ва ҳам неоваскуляризатсия дар in vivo аз ҷониби pFHHSiD пурра боздошта шуданд (Расми 1c, d, доираҳо). Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки DEET ангиогенезро тавассути роҳе, ки ба антагонистҳои интихобӣ ретсепторҳои M3 ё siRNA-и M3 ҳассос аст, мусоидат мекунад.
AChE ҳадафи молекулавии DEET мебошад. Доруҳо ба монанди донепезил, ки ҳамчун ингибиторҳои AChE амал мекунанд, метавонанд ангиогенези EC-ро дар in vitro ва дар моделҳои ишемияи пойҳои муш ҳавасманд кунанд14. Мо таъсири ду консентратсияи DEET-ро ба фаъолияти ферментҳои AChE дар HUVEC санҷидем. Консентратсияҳои паст (10-8 М) ва баланди (10-5 М) DEET фаъолияти эндотелиалии AChE-ро дар муқоиса бо шароити назоратӣ коҳиш доданд (Расми 2).
Ҳарду консентратсияи DEET (10-8 M ва 10-5 M) фаъолияти ацетилхолинэстеразаро дар HUVEC коҳиш доданд. BW284c51 (10-5 M) ҳамчун назорати ингибиторҳои ацетилхолинэстераза истифода шуд. Натиҷаҳо ҳамчун фоизи фаъолияти AChE дар HUVEC, ки бо ду консентратсияи DEET табобат карда шудааст, дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои бо воситаи нақлиёт коркардшуда ифода карда мешаванд. Арзишҳо ҳамчун миёнаи ± SEM-и шаш таҷрибаи мустақил ифода карда мешаванд. *p < 0.05 дар муқоиса бо назорати назорат (озмоиши муқоисавии сершумори Крускал-Уоллис ва Данн).
Оксиди нитрик (NO) дар раванди ангиогенӣ 33 иштирок мекунад, аз ин рӯ, истеҳсоли NO дар HUVEC-ҳои бо DEET ҳавасмандшуда омӯхта шуд. Истеҳсоли NO-и эндотелиалии бо DEET коркардшуда дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои назоратӣ афзоиш ёфт, аммо танҳо дар миқдори 10-8 М ба аҳамият расид (Расми 3c). Барои муайян кардани тағйироти молекулавӣ, ки истеҳсоли NO-и бо DEET ба вуҷудомадаро назорат мекунанд, ифода ва фаъолсозии eNOS бо истифода аз Вестерн-блоттинг таҳлил карда шуданд. Гарчанде ки табобати DEET ифодаи eNOS-ро тағйир надод, он фосфорилятсияи eNOS-ро дар макони фаъолшавии худ (Ser-1177) ба таври назаррас афзоиш дод ва дар айни замон макони ингибитории онро (Thr-495) дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои табобатнашуда дар фосфорилятсияи eNOS коҳиш дод (Расми 3d). Ғайр аз ин, таносуби eNOS-и фосфорилшуда дар макони фаъолсозӣ ва макони ингибиторӣ пас аз ба эътидол овардани миқдори eNOS-и фосфорилшуда ба миқдори умумии фермент ҳисоб карда шуд. Ин таносуб дар HUVEC-ҳое, ки бо ҳар як консентратсияи DEET коркард шудаанд, дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои табобатнашуда ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расми 3d).
Ниҳоят, ифодаи VEGF, яке аз омилҳои асосии проангиогенӣ, бо истифода аз Вестерн-блоттинг таҳлил карда шуд. DEET ифодаи VEGF-ро ба таври назаррас афзоиш дод, дар ҳоле ки pFHHSiD ин ифодаро комилан манъ кард.
Азбаски таъсири DEET ҳам ба блокадаи фармакологӣ ва ҳам ба паст шудани танзими ретсепторҳои M3 ҳассос аст, мо фарзияеро санҷидем, ки DEET метавонад сигнализатсияи калсийро тақвият диҳад. Бо тааҷҷуб, DEET натавонист калсийи ситоплазмиро дар HUVEC (маълумот нишон дода нашудааст) ва HEK/M3 (Расми 4a, b) барои ҳарду консентратсияи истифодашуда афзоиш диҳад.
Вақти нашр: 30 декабри соли 2024