Пеститсидҳо дар ҳалли мушкилоти норасоии ғизо дар саросари ҷаҳон ва мубориза бо бемориҳои инсонӣ, ки аз векторҳо мегузаранд, нақши муҳим мебозанд. Аммо, мушкилоти афзояндаи муқовимат ба пеститсидҳо фавран кашфи пайвастагиҳои наверо талаб мекунад, ки ҳадафҳои кам истифодашавандаро ҳадаф қарор медиҳанд. Каналҳои потенсиали ретсепторҳои муваққатии ҳашарот (TRPV) - Нанчжун (Нан) ва ғайрифаъол (Иав) - метавонанд каналҳои гетерологӣ (Нан-Иав) ташкил кунанд ва дар узвҳои механикӣ ҷойгир шаванд, ки геотропизм, шунавоӣ ва проприосепсияро дар ҳашарот миёнаравӣ мекунанд. Баъзе пеститсидҳо, ба монанди афидопирролидон (AP), тавассути механизмҳои номаълум ба Нан-Иав ҳадаф мегиранд. AP бар зидди ҳашароти сӯрохкунанда-маккан (гемиптеранҳо) самаранок аст ва бо вайрон кардани вазифаи риштаҳо аз ғизогирӣ пешгирӣ мекунад. AP метавонад танҳо ба Нан пайваст шавад, аммо танҳо Нан-Иав метавонад бо агонистҳо, аз ҷумла никотинамидҳои эндогенӣ (NAM) ҳамкорӣ кунад ва бо ин васила фаъолияти каналро нишон диҳад. Бо вуҷуди потенсиали Нан-Иав ҳамчун ҳадафи инсектисид, дар бораи ҷамъшавии канали он, ҷойҳои танзимкунандаи пайвастшавӣ ва танзими вобаста ба Ca2+ кам маълумот мавҷуд аст, ки ба рушди минбаъдаи инсектисидҳо монеъ мешавад. Дар ин таҳқиқот, микроскопияи криоэлектронӣ барои муайян кардани сохтори Nan-Iav дар ҳашароти Hemiptera дар ҳолати бе калмодулин-лиганд, инчунин бо AP ва NAM дар сарҳади домени такрории ситоплазмаи анкирин (ARD) истифода шуд. Бо тааҷҷуб, мо муайян кардем, ки худи сафедаи Nan метавонад пентамерро ташкил диҳад, ки бо таъсири мутақобилаи ARD-и тавассути AP ба вуҷуд омада устувор мешавад. Ин таҳқиқот таъсири мутақобилаи молекулавӣ байни инсектисидҳо ва агонистҳо ва Nan-Iav-ро ошкор мекунад ва аҳамияти ARD-ро дар функсия ва ҷамъшавии канал нишон медиҳад ва механизми танзими Ca2+-ро меомӯзад.
Дар пасманзари тағйирёбии иқлими рӯзафзуни ҷаҳонӣ, бадтар шудани амнияти озуқавории ҷаҳонӣ яке аз мушкилоти асосии асри 21 буда, барои ҷомеа оқибатҳои ногувор дорад.1,2Дар гузориши Созмони Ҷаҳонии Беҳдошт "Ҳолати амнияти озуқаворӣ ва ғизо дар ҷаҳон дар соли 2023" (SOFI) тахмин зада мешавад, ки тақрибан 2,33 миллиард нафар дар саросари ҷаҳон аз ноамнии ғизоии миёна то шадид азият мекашанд, ки ин мушкили тӯлонӣ аст.3,4Мутаассифона, ҳар сол тақрибан аз 20% то 30% ё бештар аз ҳосили зироатҳо аз ҷониби ҳашарот ва микроорганизмҳои патогенӣ аз даст дода мешаванд ва интизор меравад, ки гармшавии глобалӣ муқовимат ба ҳашарот ва осебпазирии зироатҳоро боз ҳам шадидтар кунад.4,5,6,7,8Рушди пеститсидҳо на танҳо барои ҳифзи зироатҳо аз ҳашароти зараррасон ва кам кардани паҳншавии патогенҳои векторӣ, балки барои мубориза бо бемориҳои инсонӣ, ки аз векторҳо мегузаранд, ба монанди таби денге, малярия ва бемории Чагас, ки ба пеститсидҳо рӯ ба афзоиш доранд, муҳим аст.5,9,10,11
Аз ҷумлаи ҳадафҳои асосии инсектисидҳои нейротоксикӣ, канали гетеротетрамерии TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) синфи ҳадафҳои инсектисидҳоро ифода мекунад, ки танҳо дар даҳсолаи охир кашф шудаанд, аз ҷумла инсектисидҳои дастраси тиҷорӣ ба монанди имидаклоприд ва пираклостробин.12,13,14Инсектисиди нимсинтетикии афидопирролифен (AP) як маҳсулоти ба наздикӣ таҳияшуда ва тиҷоратӣ мебошад, ки ҷузъи асосии он инсектисиди фаъоли Inscalis® мебошад, ки AP-ро дар сатҳи фаъолияти зернаномолӣ мепайвандад.15AP барои гардолудкунандагон, ҳашароти судманд ва дигар организмҳои ғайриҳадафӣ заҳролудии пасти шадид нишон медиҳад ва ҳангоми истифода мувофиқи дастурҳои тамғакоғаз, он метавонад фишори муқовиматро ба дигар инсектисидҳо коҳиш диҳад.16,17,18Нан ва Иав ба таври васеъ дар байни намудҳои ҳашарот паҳн шудаанд, танҳо дар нейронҳои ретсепторҳои кашиши хордалии антеннаҳо ва дасту пойҳо якҷоя ифода меёбанд ва барои шунавоӣ, дарки ҷозиба ва проприосепсия муҳиманд.13,16,19,20,21,22AP, имидаклоприд ва пираклостробин комплекси Нан-Иавро тавассути механизми беназир ҳавасманд мекунанд ва дар ниҳоят интиқоли сигнали проприоцептивиро бозмедоранд.13,16,23Дар ҳашароти маккандаи сӯрохкунанда (гемиптеранҳо) ба монанди битҳо ва пашшаҳои сафедпӯст, аз даст додани проприосепсия қобилияти ғизогирии онҳоро коҳиш медиҳад ва дар ниҳоят ба марг оварда мерасонад.13,24Ҷолиб он аст, ки AP ба комплекси Nan-Iav майли баланд ва ба Nan майли паст нишон медиҳад. Пайвастшавии AP ба Nan-Iav ҷараёни электрикиро ба вуҷуд меорад, аммо пайвастшавӣ ба Nan фаъолияти каналро ҳавасманд намекунад. Худи Iav умуман ба AP пайваст намешавад.16Ин нишон медиҳад, ки Nan ва Iav метавонанд барои ташкили комплексҳои гуногуни канали Nan-Iav пайваст шаванд (масалан, бо таносубҳои гуногуни стехиометрӣ ё тартиботи гуногун дар дохили як таносуби стехиометрӣ) ё AP метавонад ба якчанд ҷой пайваст шавад. Ғайр аз ин, никотинамидҳои агонисти табиӣ (NAM) бо аффинитети микромолярӣ ба Drosophila Nan-Iav пайваст мешаванд ва таъсири монанд ба афидҳо (AP)-ро дар in vitro нишон медиҳанд.16,25ва монеъ шудан ба афзоиш ва ғизогирии кирмҳо, ки дар ниҳоят ба марги онҳо оварда мерасонад25,26Ин маълумот саволҳои зиёдеро ба миён меорад. Масалан, норавшан боқӣ мемонад, ки чӣ гуна гетеродимери Nan-Iav ташкил мешавад, кадом сайтҳои пайвастшавӣ барои модулятсияи молекулаҳои хурд истифода мешаванд ва чӣ гуна ин молекулаҳои хурд функсияи каналро тавассути пахш кардани проприосепсия танзим мекунанд. Ғайр аз ин, сабабҳои он ки худи Nan ғайрифаъол аст ва ба AP наздикии паст дорад, дар ҳоле ки гетеродимери Nan-Iav фаъол аст ва AP-ро бо наздикии баландтар мепайвандад, норавшан боқӣ мемонад. Ниҳоят, дар бораи танзими вобаста ба Ca2+-и функсияи Nan-Iav ва чӣ гуна он ба равандҳои сигнализатсияи нейронӣ ворид карда мешавад, маълумоти кам мавҷуд аст.13,21
Дар ин таҳқиқот, бо истифода аз микроскопияи криоэлектронӣ, электрофизиология ва усулҳои пайвастшавии радиолиганд, мо ҷамъшавии Nan-Iav ва механизми пайвастшавии онро ба танзимгарони молекулаҳои хурд равшан кардем. Ғайр аз ин, мо калмодулин (CaM)-ро ба Iav ва пентамерҳои Nan-и устуворшудаи AP муайян кардем. Ин натиҷаҳо фаҳмиши муҳимро дар бораи танзими ионҳои калсий дар каналҳо, ҷамъшавии каналҳо ва омилҳое, ки наздикии пайвастшавии лигандро муайян мекунанд, фароҳам меоранд. Муҳимтар аз ҳама, мо тасдиқ кардем, ки ARD дар ин равандҳо нақши марказӣ дорад. Таҳқиқоти мо дар бораи каналҳои пурраи ҳашарот, ки ба пестисидҳои дахлдори кишоварзӣ пайвастанд.27, 28, 29дурнамои рушди саноати пеститсидҳоро фароҳам меорад, самаранокӣ ва хосияти пеститсидҳоро беҳтар мекунад ва имкон медиҳад, ки пайвастагиҳои ба TRPV нигаронидашуда ба дигар намудҳо барои ҳалли мушкилоти амнияти озуқавории ҷаҳонӣ ва паҳншавии бемориҳои тавассути векторҳо интиқолшаванда истифода шаванд.
Мо инчунин муайян кардем, ки Nan-Iav аз ҷониби Ca2+ танзим карда мешавад ва механизми танзим тавассути CaM-и ба таври конститутивӣ пайвастшуда ба амал меояд. Муҳим он аст, ки ин танзими вобаста ба Ca2+-и Nav аз ҷониби CaM аз механизмҳои танзими дигар каналҳои ионӣ (масалан, каналҳои Na+ бо шиддат ва каналҳои TRPV5/6) ба таври назаррас фарқ мекунад.52,53,54,55,56,57Дар канали Nav1.2, домени C-терминали CaM бо домени C-терминалӣ (CTD) ба таври спиралӣ пайваст мешавад ва Ca2+ пайвастшавии домени N-терминали худро ба қисми дисталии CTD ба вуҷуд меорад.56Дар канали TRPV5/6, домени C-терминали CaM ба CTH пайваст мешавад ва Ca2+ васеъшавии домени N-терминали худро ба сӯрохиҳо ба боло мебарад ва бо ин васила гузариши катионро масдуд мекунад.53,54Мо моделеро барои функсияи танзимшавандаи Ca2+-и Nan-Iav-CaM пешниҳод мекунем (Расми 4h). Дар ин модел, домени N-терминали CaM ба таври доимӣ ба домени C-терминали (CTH)-и Iav пайваст мешавад. Дар ҳолати оромӣ (консентратсияи пасти [Ca2+]), домени C-терминали CaM бо Nan ҳамкорӣ мекунад ва конформатсияи ARD-ро устувор мекунад ва бо ин васила кушодашавии каналро мусоидат мекунад. Пайвастшавии агонист/инсектисид ба канал боиси кушодашавии сӯрохиҳо мегардад, ки боиси воридшавии Ca2+ мегардад. Сипас Ca2+ ба CaM пайваст мешавад ва боиси ҷудошавии домени C-терминал аз ARD-и Nan мегардад. Азбаски бастани пайвастшавии CaM асосан таъсири ингибитории Ca2+-ро аз байн мебарад, ин ҷудошавӣ ҳаракати ARD-ро танзим мекунад ва бо ин васила боиси боздоштани Ca2+ ё десенсибилизатсия мегардад. Барқароршавии босуръати ҷараёнҳои канал пас аз элюсияи ионҳои калсий (Расми 4g) нишон медиҳад, ки ин механизм вокунишҳои зудро ба сигналҳои нейронии Ca2+ мусоидат мекунад. Ғайр аз ин, гузориш дода шудааст, ки минтақаи C-терминали Iav, ки то ҳол ба таври кофӣ омӯхта нашудааст, дар ҳадафгирии каналҳо ва танзими ҷорӣ нақшҳои дигар мебозад.21
Ниҳоят, таҳқиқоти мо сохтори баланди комплекси канали TRP-и инсектисид-инсектисидӣ, ки аҳамияти кишоварзӣ дорад, пешниҳод мекунад - кашфиёте, ки қаблан барои мо номаълум буд. Қобили зикр аст, ки мо сохтор ва вазифаи канали ҳашаротро дар ҳуҷайраҳои инсон (HEK293S GnTi–), на дар ҳуҷайраҳои ҳашарот, тавсиф кардем. Дар баробари афзоиши муқовимат ба инсектисидҳо ва фишори доимӣ ба амнияти озуқаворӣ ва патогенҳо, кори мо маълумоти муҳимеро пешниҳод мекунад, ки ба таҳияи инсектисидҳои нав барои манфиати саломатии инсон ва амнияти озуқавории ҷаҳонӣ мусоидат мекунад. Таҳқиқот нишон доданд, ки инсектисидҳо ба монанди AP ҳангоми истифода мувофиқи дастурҳои тамғакоғаз бар зидди баъзе ҳашарот самаранок мебошанд ва барои гардолудкунандагони муфид заҳролудии пасти шадид доранд, ки бехатарии экологии онҳоро нишон медиҳад.13,16Ғайр аз ин, озмоиши баъзе ҳосилаҳои AP дар пашшаҳо нишон дод, ки онҳо дар ниҳоят қобилияти парвоз карданро аз даст медиҳанд. Фаҳмидани он, ки чӣ гуна ин пайвастагиҳои модулятсиякунанда ба Nan-Iav пайваст мешаванд, тағир додани пайвастагиҳои мавҷуда ё таҳияи пайвастагиҳои навро барои самараноктар ва...дақиқмубориза бо ҳашароти зараррасон. Тадқиқоти мо нишон медиҳад, ки интерфейси Nan-Iav ARD на танҳо барои танзими фаъолияти пайвастагиҳои эндогенӣ, пеститсидҳо ва Ca2+-CaM, балки барои ҷамъшавии каналҳо низ муҳим аст. Мо пешниҳод мекунем, ки халалдор кардани ҷамъшавии гетеродимерҳо бо молекулаҳои хурд метавонад як равиши беназир ва умедбахш барои таҳияи ингибиторҳои каналҳои ион бошад.
Аз ҳашт гени ортологӣ, генҳои пурраи гамбуски қаҳваранг (Halyomorpha halys) Nanchung ва Inactive интихоб карда шуданд, ки дар шустушӯйҳо устувории аъло нишон доданд. Генҳои синтезшуда барои ифодаи инсон аз ҷиҳати кодон оптимизатсия карда шуданд ва бо истифода аз сайтҳои маҳдудкунии XhoI ва EcoRI ба вектори pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) клонида шуданд. Ин кафолат дод, ки клонҳо дар чаҳорчӯба бо тегҳои C-терминали GFP-FLAG-10xHis ва mCherry-FLAG-10xHis, ки аз ҷониби протеазаи HRC-3C (PPX) бурида мешаванд, ҷойгир карда шудаанд ва имкон медиҳанд, ки мустақилона...ифодаПраймерҳое, ки барои клон кардани Nanchung ва Inactive ба вектори pBacMam истифода мешуданд, чунин буданд:
Тасвирҳои микроскопии зарраҳои алоҳида дар микроскопи электронии интиқоли Titan Krios G2 (FEI), ки бо камераи K3 ва филтри энергияи Gatan BioQuantum муҷаҳҳаз шудааст, гирифта шуданд. Микроскоп бо 300 кэВ, бо танзимоти энергияи 20 эВ, андозаи пиксели намуна 1.08 Å/пиксел (бузургкунии номиналӣ 81,000x) ва градиенти дефокус аз -0.8 то -2.2 мкм кор мекард. Сабти видео бо суръати 40 кадр дар як сония бо истифода аз микроскопи Latitude S (Gatan) бо суръати вояи номиналии 25 e–px−1 s−1, вақти экспозитсия 2.4 сония ва вояи умумии тақрибан 60 e–Å−2 анҷом дода шуд.
Ислоҳи ҳаракати аз шуоъ ба вуҷуд омада ва вазнгирии воя дар плёнка бо истифода аз MotionCor2 дар RELION 4.061 анҷом дода шуд. Арзёбии параметрҳои функсияи интиқоли контраст (CTF) дар cryoSPARC бо истифода аз усули арзёбии CTF дар асоси патч62 анҷом дода шуд. Фотомикрографҳо бо қарори мувофиқкунии CTF ≥4 Å аз таҳлили минбаъда хориҷ карда шуданд. Одатан, як зермаҷмӯи 500-1000 фотомикрограф барои интихоби нуқта дар cryoSPARC истифода шуд ва баъдан пас аз филтркунӣ якчанд даври таснифоти 2D барои ба даст овардани тасвири равшани истинод барои интихоби зарраҳо дар асоси шаблон анҷом дода шуд. Сипас зарраҳо бо истифода аз қуттиҳои маҳдудкунандаи 64-пикселӣ ва биннинги 4-қабатӣ истихроҷ карда шуданд. Якчанд даври таснифоти 2D барои хориҷ кардани категорияҳои зарраҳои номатлуб анҷом дода шуданд. Модели ибтидоии 3D бо истифода аз барқарорсозии ab initio барқарор карда шуд ва бо истифода аз такмилдиҳии ғайринақдӣ дар cryoSPARC такмил дода шуд. Таснифоти 3D дар cryoSPARC ё RELION дар асоси гетерогении ARD анҷом дода шуд. Ҳеҷ гуна гетерогении назарраси доменҳои мембрана мушоҳида нашуд. Зарраҳо бо истифода аз усулҳои C1 ва C2 такмил дода шуданд; зарраҳое, ки қарори баландтари C2 доштанд, нисбат ба C2 симметрӣ ҳисобида шуданд ва барои такмили Байес ба RELION ворид карда шуданд. Сипас, зарраҳо барои такмили ниҳоии ғайримутаносиб ва маҳаллӣ ба cryoSPARC интиқол дода шуданд. Қарори ниҳоӣ ва шумораи зарраҳо дар Ҷадвали 1 нишон дода шудаанд.
Ҳангоми коркарди пентамерҳои Nan+AP, мо усулҳои гуногунро барои беҳтар кардани ҳалли доменҳои мембрана (хусусан минтақаи сӯрохӣ), ба монанди тарҳи сигнал ва ниқобкунии TMD, омӯхтем. Аммо, ин кӯшишҳо аз сабаби ихтилоли эҳтимолии шадид дар минтақаи сӯрохӣ ва гетерогении умумии TMD номуваффақ буданд. Қарори ниҳоӣ бо истифода аз ниқоб, ки ба таври худкор бо усули коркарди ғайримуқаррарӣ дар cryoSPARC тавлид мешавад, ҳисоб карда шуд ва асосан минтақаи ARD-ро ҳадаф қарор дод. Ин нисбат ба қарори доменҳои мембрана (хусусан минтақаи VSLD) ба таври назаррас баландтар расид.
Моделҳои ибтидоии де-ново аз шаклҳои апои ҳашароти Нанчунг ва ғайрифаъол аввал бо истифода аз Coot63 тавлид карда шуданд ва моделҳои ҳашароти Нан ва Иав бо истифода аз AlphaFold264 барои муайян кардани минтақаҳои эътимоди паст тавлид карда шуданд. Моделсозии калмодулин ба мувофиқати ҷисми сахти моделҳои пайвастшавандаи Ca2+ ва Ca2+-ро дар сабтҳои PDB мутаносибан 4JPZ56 ва 1CFD65 асос ёфта буд. Моделҳо бо истифода аз такмили сферӣ такмил дода шуданд, то стереохимияи дуруст ва геометрияи хуб таъмин карда шаванд. Сипас фосфатидилхолин, фосфатидилетаноламин ва фосфатидилсерин ҳамчун зичии хуб муайяншудаи липидҳо модел карда шуданд ва лигандҳои NAM ва AP дар зичии мувофиқ дар пайвандҳои танг ҷойгир карда шуданд. Файлҳои маҳдудият аз сатри SMILES-и изоформаҳо бо истифода аз eLBOW дар PHENIX66 тавлид карда шуданд. Дар ниҳоят, моделҳо дар фазои воқеӣ дар PHENIX бо истифода аз ҷустуҷӯи шабакаи маҳаллӣ ва кам кардани глобалӣ бо маҳдудиятҳои сохтори дуюмдараҷа такмил дода шуданд. Сервери MolProbity барои такмили модел ва таҳлили сохторӣ истифода шуд ва тасвирҳо бо истифода аз PyMOL ва UCSF Chimera X анҷом дода шуданд. 67,68,69 Таҳлили диафрагма бо истифода аз сервери HOLE анҷом дода шуд,70 ва харитасозии ҳифзи пайдарпайӣ бо истифода аз сервери Consurf анҷом дода шуд.71
Таҳлили оморӣ бо истифода аз Igor Pro 6.2, Excel Office 365 ва GraphPad Prism 7.0 анҷом дода шуд. Ҳамаи маълумоти миқдорӣ ҳамчун миёна ± хатои стандартӣ (SEM) пешниҳод карда мешаванд. Барои муқоисаи ду гурӯҳ санҷиши t-и Стюдент (дуҷуфт, беҷуфт) истифода шуд. Барои муқоисаи гурӯҳҳои сершумор таҳлили яктарафаи дисперсия (ANOVA) ва баъдан санҷиши пост-хоки Даннетт истифода шуд. *P< 0.05, **P< 0.01 ва ***PВобаста ба тақсимоти маълумот, <0.001 аз ҷиҳати оморӣ аҳамиятнок ҳисобида шуданд. Арзишҳои Kd, Ki ва фосилаҳои эътимоднокии асимметрии 95% -и онҳо бо истифода аз GraphPad Prism 10 ҳисоб карда шуданд.
Барои гирифтани маълумоти бештар дар бораи методологияи тадқиқот, лутфан ба Хулосаи гузориши портфели табиат, ки дар ин мақола пайванд шудааст, нигаред.
Модели ибтидоӣ бо истифода аз моделҳои калмодулин аз пойгоҳҳои додаҳои PDB 4JPZ ва 1CFD сохта шудааст. Координатаҳо дар Бонки додаҳои Сафеда (PDB) таҳти рақамҳои сабти 9NVN (Nan-Iav-CaM бе лиганд), 9NVO (Nan-Iav-CaM, ки ба никотинамид пайваст аст), 9NVP (Nan-Iav-CaM, ки ба никотинамид ва EDTA пайваст аст), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, ки ба афенидолпирроллин ва калсий пайваст аст), 9NVR (Nan-Iav-CaM, ки ба афенидолпирроллин ва EDTA пайваст аст) ва 9NVS (Nan пентамер, ки ба афенидолпирроллин пайваст аст) ҷойгир карда шудаанд. Тасвирҳои мувофиқи микроскопияи криоэлектронӣ дар Пойгоҳи додаҳои микроскопияи электронӣ (EMDB) таҳти рақамҳои зерини сабт ҷойгир карда мешаванд: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM бе лиганд), EMD-49845 (комплекси Nan-Iav-CaM бо никотинамид), EMD-49846 (комплекси Nan-Iav-CaM бо никотинамид ва EDTA), EMD-49847 (комплекси Nan-Iav-CaM бо афидопирроллин ва калсий), EMD-49848 (комплекси Nan-Iav-CaM бо афидопирроллин ва EDTA) ва EMD-49849 (комплекси Nan пентамер бо афидопирроллин). Маълумоти хом барои таҳлили функсионалӣ дар ин мақола пешниҳод карда мешаванд.
Вақти нашр: 28 январи соли 2026